miR-181a在子宫内膜癌中的诊断价值*

贡继尧，宋梓萌，陈 媛，曾美迪，李世宝,2△

1.徐州医科大学医学技术学院，江苏徐州 221000；2.徐州医科大学附属医院检验科，江苏徐州 221000

子宫内膜癌(EC)是目前全球女性中最常见的恶性肿瘤之一[1]，在中国仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤第二位，而在发达国家居于首位[2]，好发于围绝经期和绝经后女性。近年来，EC在世界范围内的发病率持续上升，平均发病年龄也越来越小[3]，但其具体病因尚不清楚。2019年国家癌症中心统计称在我国EC的发病率为10.28/10万，死亡率为1.9/10万[4]。2020年，全球共有417 367例新诊断病例，由EC导致的死亡人数高达97 370人[5]。目前临床较为常见的诊断标志物是人卵巢癌抗原(CA125)[6]，但其诊断EC的灵敏度和特异度不佳[7]，使血清肿瘤标志物在临床上受到极大的限制。而诊断性刮宫术作为其早期诊断的金标准具有侵袭性，因此，亟须发现一种灵敏度高且易获得的EC诊断标志物来提高EC的诊断效率。

miR-181a是一种微小RNA(miRNA)，广泛分布于人类细胞中，发挥着调控细胞发育和分化的作用[8]。相关研究证实，miR-181a在EC患者的肿瘤组织中表达水平上升[9]，提示miR-181a具备作为EC标志物的潜能。但组织标本获取的侵入性限制了其临床应用，而血清标本获取相对简单，并且miRNA在血清中也较为稳定[10]，可以为诊断提供了一种无创的、经济的方法。因此，本研究拟通过检测EC患者血清miR-181a水平，探讨miR-181a在EC诊断中的价值及其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年8月至2022年3月在徐州医科大学附属医院确诊的EC患者血清标本47份(EC组)，女性体检健康者血清标本25份(对照组)。EC组患者年龄45～74岁，平均(58.0±7.6)岁；对照组年龄47～68岁，平均(57.4±6,2)岁。纳入标准：所有患者经诊断性刮宫检查证实为EC；纳入本研究前未经任何手术、放疗、化疗等治疗。排除标准：其他肿瘤患者；心、肺、肾、神经系统等疾病患者；严重精神类疾病患者。本研究获得徐州医科大学附属医院伦理委员会批准，所有患者及健康者均知情同意并签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器 miR-181a及U6引物、反转录试剂盒、PCR试剂盒均购自中国北京天根生化有限公司。TRNzol Universal总RNA提取试剂购自Life technologies公司,PCR扩增仪购自Bio-Rad公司，ABI 7500实时定量PCR仪购自Applied Biosystems公司。

1.3总RNA的提取与实时荧光定量PCR(qPCR) 将存放于-80 ℃的血清标本在室温下融解，取200 μL血清置于无核酶Ep管中，按照Trnzol Universal总RNA提取试剂说明书提取血清总RNA。使用分光光度计检测提取RNA的纯度和浓度，用于后续实验。以260 nm和280 nm处的吸光度比值(A260/A280)在1.8～2.0为最佳。按照反转录试剂盒说明书配制反应体系(总体系20 μL)将提取的RNA在荧光定量PCR扩增仪上反转录为cDNA，反转录程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 3 min，之后保持10 ℃。得到的cDNA标本保存在-20 ℃冰箱中备用。以1 μL cDNA为模板，按照PCR试剂盒配制反应体系20 μL，PCR条件：95 ℃孵育15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。采用相对定量法，以U6作为内参，每个实验标本设置3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算血清mir-181a的相对表达水平。

1.4统计学处理 采用GraphPad Prism8.0分析软件进行数据分析。计量资料呈非正态分布，两组间比较采用Mann-WhitneyU秩和检验；计数资料以例数、率表示，组间比较采χ2检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血清miR-181a对EC的临床诊断价值，并计算曲线下面积(AUC)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1EC组和对照组血清miR-181a水平比较 qPCR法检测miR-181a水平，试验过程中血清标本未被污染，且未出现引物二聚体或非特异性扩增，结果较可靠。EC组血清miR-181a水平明显高于对照(P<0.05)，见图1。

图1 对照组与EC组血清mir-181a水平比较

2.2miR-181a对EC的诊断价值 ROC曲线分析结果显示，血清miR-181a诊断EC的AUC为0.889 8(95%CI：0.816 5～0.963 1，P<0.05)，灵敏度为91.49%，特异度为72.00%，见图2。

图2 血清miR-181a诊断EC的ROC曲线

2.3EC患者血清miR-181水平与临床病理特征的关系 以血清miR-181a的中位数(8.386)为界，miR-181≥8.36的EC患者为高表达组(24例)，miR-181a<8.386的EC患者为低表达组(23例)。高表达组肌层浸润深度≥2 cm的患者比例高于低表达组(P<0.05)，而两组年龄、分化程度、免疫组化及有无淋巴结转移、炎性改变、癌累及其他部位比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 EC血清miR-181a表达水平与临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨 论

miRNA是近年来用于肿瘤诊断的新型标志物。miRNA与细胞的增殖、分化、凋亡和代谢密切相关，对机体生理状态的维持和细胞发育起重要作用[11]。现有不少研究证明，miRNA是影响EC发生、发展的重要因素[12]。BOREN等[13]研究了与EC发生相关的miRNA及其靶信使RNA，发现在正常子宫内膜演变为子宫内膜非典型增生过程中，有13种miRNA存在不同程度的差异性表达，提示miRNA在EC中可能发挥了促癌基因和抑癌基因的功能。此外，miRNA在疾病中特异性表达，且在血清中稳定存在，不易被血液中的核糖核酸酶降解[14]。这些结果提示，血清miRNA作为肿瘤标志物在EC的发生、发展，早期诊断，以及预后预测方面具有十分重要的意义。

miR-181a位于人9号染色体上，不少研究发现miR-181a的差异化表达与肿瘤的发生密切相关[15]，在许多恶性肿瘤中均表达失调。华佳叶等[16]研究发现，miR-181a在急性髓细胞性白血病中高表达，其通过促进HL-60细胞株的增殖来发挥促癌作用。YANG等[17]推测miR-181a在口腔鳞状细胞癌中发挥了癌基因调控作用。此外，有研究表明，胃癌患者血清中miR-181a表达量明显上调，可以作为肿瘤标志物进一步研究[18]。国内外均有关于miR-181a对EC影响的报道，但重点均放在了研究miR-181a对EC组织细胞的作用上。有研究人员发现，miR-181a在EC患者的新鲜冰冻组织标本中表达上调，认为miR-181a可能通过抑制其靶基因PR的表达进而调节EC的发生、发展[19]。但是目前关于miR-181a在EC血清中的表达及临床意义的研究较少。

本研究运用qPCR检测发现在EC组血清中miR-181a水平明显高于对照组(P<0.05)，表明miR-181a可能在EC的发生机制中起促癌基因作用。

本课题组认为，在EC发病和进展过程中，因EC组织中肿瘤细胞逃逸或死亡，释放基因组DNA入血，导致外周血中miR-181a水平升高，miR-181a的这种特异性变化可作为EC诊疗的无创性分子标记物，对其进行检测，将有助于EC检出和治疗效果的监控，但其具体调控机制仍需进一步研究。

综上所述，miR-181a在EC患者血清中水平升高，其可能参与了EC的发生、发展，提示miR-181a是一个潜在的诊断EC的标志物。