畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离鉴定与特性分析

王 莹，卢葛锦，景 洁，祝令伟，关佳瑶，郑 林，孙诗雯，刘铭威，纪 雪，郭学军

(中国农业科学院长春兽医研究所，吉林长春 130122)

黏菌素(又称多黏菌素E)是阳离子多肽家族抗生素的成员之一，黏菌素作为甲烷磺酸黏杆菌素上市已有50余年的历史[1]。黏菌素通过与革兰氏阴性菌细胞外膜脂多糖相互作用，破坏细胞膜的通透性，导致细菌死亡或者抑制细菌生长，因此黏菌素是最早对革兰氏阴性菌具有显著杀灭活性的抗生素之一[2]。但是由于黏菌素具有神经毒性和肾毒性等副作用，从20世纪80年代开始，已经逐渐被低毒性的新型抗生素取代，只在畜牧养殖中用于预防和治疗畜禽胃肠道疾病以及促进动物生长。近年来，随着多重耐药革兰氏阴性菌的增多，尤其是耐碳青霉烯肠杆菌的出现，使人畜面临“无药可用”的威胁，黏菌素作为治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的 “最后一道防线”显得尤为重要[3]。

黏菌素作为动物饲料添加剂已被广泛使用了半个多世纪，人们一直认为黏菌素耐药是固有耐药，无法水平传递，直到2015年在中国的养殖场首次发现了携带可移动黏菌素耐药性基因mcr-1质粒的大肠埃希氏菌，随后对人和多种动物的样品研究发现，多种质粒都可以携带mcr-1基因，而且这些质粒可以在不同种的细菌中进行水平传递[4]。在发现mcr-1之后的4年内，全球50多个国家和地区的动物、肉类产品、人类(包括粪便携带和感染)和环境中都报告了mcr-1基因阳性细菌[5-6]。mcr-1基因在人和动物中的广泛传播引起了关于黏菌素使用政策的全球讨论[7]。2016年，欧洲药品管理局(European medicines agency)将黏菌素耐药性的风险水平从低更新为高[8]。2017年4月30日起，根据中国农业部2 428号公告，中国大陆地区禁止使用硫酸黏菌素预混料作为动物生长促进剂[9]。

尽管制定了限制黏菌素在农业中的使用的政策，但其后续效果还需要进行评价。本试验通过对吉林省长春市3 个畜禽养殖场在2017年和2020年两个时间点所采集的样品进行耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离与鉴定，对分离到的耐黏菌素大肠埃希氏菌进行了16 种常用药物的敏感性测定，并对mcr基因阳性菌株进行筛选以及对其所携带的复制子进行分型鉴定，以期评估政策施行及产生的影响，并了解耐黏菌素大肠埃希氏菌的耐药性，以及质粒复制子携带情况。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2017年5月和2020年12月在长春3 个畜禽养殖场采集373 份粪便样品，具体见表1。

表1 粪便样品采集信息

1.1.2 试剂 ECC显色培养基，法国科玛嘉公司产品；脑心液体培养基、麦康凯琼脂培养基，青岛高海博生物技术有限公司产品；ID肉汤、细菌鉴定卡、AST肉汤和AST指示剂，美国BD公司产品；琼脂糖，美国Genview公司产品；DNA分子量标准DL 2000，美国TaKaRa公司产品；PBRT 2.0 kit试剂盒，意大利Diatheva生物技术公司产品。引物均由吉林库美生物科技公司合成。

1.1.3 仪器 生物安全柜(1300A2)，美国Thermo公司产品；全自动微生物生化鉴定/药敏系统(BDPhoenixTM-100)、比浊仪(PhoenixSpecTM)，美国BD公司产品；PCR扩增仪(ETC-811)，北京东胜创新生物科技有限公司产品；生化培养箱(LRH-70)，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养与纯化 将粪便样品置于4 mL离心管中，并加入2 mL生理盐水，室温振荡10 min后静置3 min，上清液即为样品原液。无菌条件下吸取20 μL原液接种于含黏菌素(2 mg/L)的ECC显色培养基上，37℃恒温倒置培养16 h。在ECC显色培养基上挑取蓝色且边缘光滑的单菌落，划线接种于黏菌素抗性(2 mg/L)麦康凯琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养16 h后，在麦康凯琼脂培养基上挑取1个～5个红色且边缘光滑的单菌落，划线接种于黏菌素抗性(2 mg/L)麦康凯琼脂培养基上，37℃恒温倒置培养16 h，进行第2次纯化。

1.2.2 细菌的PCR鉴定 将纯化好的疑似菌株接种于脑心液体培养基中，37℃振荡培养16 h后，吸取200 μL菌液，12 000 r/min离心2 min，弃去上清，加入50 μL去离子水重悬，95℃加热7 min,12 000 r/min离心1 min，上清即为模板。按参考文献[10]合成大肠埃希氏菌特异性引物16S rDNA，引物序列见表2，对分离菌株进行鉴定。利用ERIC-PCR进行指纹图谱的鉴定[11]，去除指纹一致的克隆株，引物序列见表2。

表2 试验所需引物

1.2.3 黏菌素最低抑菌浓度测定 按照2017年美国临床实验室标准化研究所(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法检测分离菌株对黏菌素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration ，MIC)。黏菌素浓度设置为16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L，每株菌设置3组重复，以标准菌株ATCC25922作为质控菌株，结果判读：以孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为菌株的MIC值。

1.2.4 药物敏感性测定 将分离的菌株接种于脑心琼脂培养基，37℃倒置培养16 h。使用无菌长棉签蘸取几个单菌落于ID肉汤中，将菌液调至0.5～0.6麦氏比浊度范围内，向AST肉汤垂直滴加46 μL AST指示剂，上下缓慢颠倒混匀，加入菌液25 μL，再次上下缓慢颠倒混匀，将肉汤缓缓倒入鉴定卡内，把鉴定卡放置于全自动微生物生化鉴定/药敏系统内对菌株进行敏感性检测，根据全自动微生物生化鉴定/药敏系统检测出的结果对菌株的敏感性进行判断。

1.2.5 耐药基因mcr的检测 多重PCR法检测分离菌株中mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5耐药基因，引物序列[12]见表2，筛选出携带mcr耐药基因的菌株。

1.2.6 质粒复制子基因分型 利用质粒复制子分型试剂盒(PBRT 2.0 kit)确定mcr基因阳性菌株中的质粒类型[13]，PCR扩增产物在25 g/L琼脂糖凝胶中于110 V电泳60 min进行分析。

2 结果

2.1 耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离鉴定

通过黏菌素抗性ECC显色培养基筛选和麦康凯显色培养基纯化，大肠埃希氏菌16S rDNA PCR特异性方法进行分离鉴定(图1)，从373份粪便样品中获得耐黏菌素(2 mg/L)大肠埃希氏菌分离株929株。经ERIC-PCR指纹图谱鉴定(图2)，去除克隆株383株，最终获得耐黏菌素大肠埃希氏菌546株，其中141株耐黏菌素大肠埃希氏菌分离自2017年样品，405株耐黏菌素大肠埃希氏菌分离自2020年样品。

M.DL 2 000 DNA Marker；-.阴性对照；+.阳性对照；1～3.样品分离株16S rDNA PCR 扩增产物

M.DL 2 000 DNA Marker；1～17.大肠埃希氏菌分离菌株ERIC-PCR 扩增产物M.DNA Marker DL 2 000;1-17.ERIC-PCR amplification products of Escherichia coli isolates

2.2 黏菌素最低抑菌浓度

546株耐黏菌素大肠埃希氏菌对黏菌素的MIC的范围为0.25 mg/L～8 mg/L，其中，2017年141株菌的MIC在2 mg/L～8 mg/L范围内有37株，占比26.24%， MIC在0.25mg/L～1mg/L范围内有104株，占比73.76%；2020年405 株菌的MIC在2 mg/L～8 mg/L范围 内有73 株，占比18.02%， MIC在0.25 mg/L～1 mg/L范围 内有332 株，占比81.98%(表3)。

表3 黏菌素最低抑菌浓度测定结果

2.3 药物敏感性试验结果

2017年141株耐黏菌素大肠埃希氏菌中，四环素耐药率最高为98.58%，其次氨苄西林、氯霉素、哌拉西林、环丙沙星、莫西沙星和左氧氟沙星耐药率在48%～80%之间，大多数菌株对头孢他啶、阿米卡星、亚胺培南和美洛培南敏感；2020年405 株耐黏菌素大肠埃希氏菌中，氯霉素耐药率最高为68.15%，略高于四环素、氨苄西林和哌拉西林耐药率，大多数菌株对头孢他啶、阿米卡星、亚胺培南和美洛培南敏感(表4)。

表4 耐黏菌素大肠埃希氏菌对16种抗菌药物敏感性结果

2.4 耐药谱分析

对546株耐黏菌素大肠埃希氏菌分离株耐受的抗生素种类及其对应的耐药菌株数、百分比进行统计和分析，结果见表5。2017年分离菌株耐受的抗生素种类有0～12种，仅有3株菌株对所有抗生素全部敏感，以耐受4种抗生素占比最高；2020年分离菌株耐受的抗生素种类有0～13种，有19株菌株对所有抗生素全部敏感，以耐受4种抗生素菌株占比最高。

表5 耐黏菌素大肠埃希氏菌耐受的抗菌药物种类占比统计

进行耐药性检测的抗生素有5类，包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、酰胺醇类、氟喹诺酮类和四环素类。根据多重耐药菌的定义，一般定义对3类及3类以上抗生素耐药的细菌为多重耐药菌。2017年菌株中，多重耐药菌为114株(80.85%，114/141)，其中对3类抗生素耐药的菌株最多，为58株(41.13%，58/141)，对所检测的四类抗生素耐药的有36株(25.53%，36/141)，对所检测的5类抗生素全部耐药的有20株(14.18%，20/141)；2020年菌株中，多重耐药菌为244株(60.25%，244/405)，其中对3类抗生素耐药的菌株最多，为143株(35.31%，143/405)，对所检测的四类抗生素耐药的有71株(17.53%，71/405)，对所检测的5类抗生素全部耐药的有30株(7.41%，30/405)。

2.5 mcr基因阳性耐黏菌素大肠埃希氏菌的检出率统计

在546 株耐黏菌素大肠埃希氏菌中检测出34株携带mcr-1基因的耐黏菌素大肠埃希氏菌(图3)，未检测出mcr-2、mcr-3、mcr-4和mcr-5基因。其中2017年141株检测出携带mcr-1基因耐黏菌素大肠埃希氏菌21株，检出率为14.89%；2020年405株检测出携带mcr-1基因耐黏菌素大肠埃希氏菌13株，检出率为3.21%。

M.DL 2 000 DNA Marker；-.阴性对照；+.阳性对照；1～3.样品分离株mcr-1基因扩增产物

2.6 质粒复制子分型结果

通过PBRT试剂盒对34株mcr-1基因阳性耐黏菌素大肠埃希氏菌进行常见质粒复制子的分型，共鉴定出12种质粒复制子的类型(表6)。2017年21株mcr-1阳性大肠埃希氏菌共检出11种质粒，各种质粒的检出率分别为IncFII为80.95%(17/21)、IncHI2为66.67%(14/21)、IncFIB为52.38%(11/21)、IncX1为38.09%(8/21)、IncX4为28.57%(6/21)、IncFIIK为28.57%(6/21)、IncI2为23.81%(5/21)、IncFIA为14.29%(3/21)、IncI1α为14.29%(3/21)、IncA/C为9.52%(2/21)、IncB/O为9.52%(2/21) 。2020年13株mcr-1基因阳性耐黏菌素大肠埃希氏菌共检出7种质粒，各种质粒的检出率分别为IncFII为92.31%(12/13)、IncFIB为92.31%(12/13)、IncX1为53.85%(7/13)、IncHI2为46.15%(6/13)、IncI2为38.46%(5/13)、IncX4为7.69%(1/13)、IncI1γ为7.69%(1/13)。

表6 34株mcr-1阳性大肠埃希氏菌质粒复制子类型

3 讨论

大肠埃希氏菌是耐药基因的天然储存库，其可以通过性菌毛将携带的耐药基因质粒传递给其他细菌，包括非同属同科细菌，并在受体菌中发生进一步的重组和变异，造成耐药基因的水平扩散和多重耐药性的产生，从而将耐药基因传播至其他肠杆菌科细菌或其他病原菌中。黏菌素类抗生素曾是规模化畜禽养殖场防治肠杆菌科细菌感染的重要抗生素之一，在规模化养殖过程中，由于抗生素的过度使用，造成了多重耐药以及超级耐药细菌的泛滥，近年来细菌的耐药情况日益严峻[14-17]。

本试验中，从检出的546株耐黏菌素大肠埃希氏菌的耐药水平(0.25 mg/L≤MIC≤8 mg/L)来看，吉林省长春市内的黏菌素耐药情况尚处于中度水平，共有110株大肠埃希氏菌MIC≥2 mg/L，2020年MIC≥2 mg/L菌株分离率(18.02%，73/405)低于2017年MIC≥2 mg/L菌株分离率(26.24%，37/141)，表明黏菌素禁用政策降低了黏菌素耐药菌株的分离率。其中34 株mcr-1阳性大肠埃希氏菌的MIC值在4 mg/L～8 mg/L之间，证实携带mcr-1基因可以使大肠埃希氏菌对黏菌素产生耐药，此外没有携带任何已知mcr基因的76株黏菌素耐药大肠埃希氏菌应有其他耐药机制导致其对黏菌素耐药，如pmrA/pmrB双组分系统突变[19]、新的mcr基因或变体[20]，或者其他未知的机制。另外，有146株耐黏菌素大肠埃希氏菌MIC值略小，导致这种现象的原因可能有几种，由于黏菌素的阳离子性质、大分子结构在琼脂中扩散不良、药粉成分以及其异质耐药性，另外传代培养和储存后都可能会丧失大肠埃希氏菌的黏菌素抗性[21]。

在16种药物的药敏结果中，除了氯霉素和头孢噻肟2种抗菌药物之外， 2020年菌株的其他抗菌药物的耐药率比2017年的耐药率均有所下降，多重耐药菌株占比也有所降低，但长春地区分离的耐黏菌素大肠埃希氏菌对四环素耐药率一直较高，应给予足够的重视，大多数菌株对氨苄西林、氯霉素和哌拉西林的耐药率依然达到60%以上，有8.64%的菌株耐抗生素的种类超过了10种，多重耐药菌占比仍达到60%以上，且耐药谱较广。鉴于以上结果，消除细菌耐药性的任务还任重道远，建议经常开展菌株的药敏检测，并依据药敏结果选择合适的抗生素以及使用合理的剂量。

本试验共检出34 株含mcr-1基因的菌株，其中2020年耐黏菌素大肠埃希氏菌mcr-1检出率(3.23%，13/405)低于2017年耐黏菌素大肠埃希氏菌mcr-1检出率(14.89%，21/141)，低于2016年本实验室中韩一啸等[10]报道的吉林省长春市猪源大肠埃希氏菌mcr-1的检出率(100%)，低于2019年孙赫等[18]报道的吉林省动物源样本mcr-1的检出率(8.65%)，并且在为了评估中国禁用黏菌素政策变化的影响，沈建忠等[8]调查了2015年至2018年中国大陆硫酸黏菌素预混料的生产情况，硫酸黏杆菌素预混料的产量每年都在下降，从2015年的27 170 t下降到2018年的2 497 t，下降幅度最大的是2016年至2017年(24 563 t至5 112 t)，预混料活性成分黏菌素的相应产量从2015年的2 736 t降至2018年的234 t， 结果表明我国农业部提出的禁止黏菌素在养殖场作为饲料添加剂使用的政策施行是有效的，并对降低mcr-1流行率产生很大的影响，但是持续的黏菌素监测是必要的，特别是作为黏菌素管理的早期预警系统。

本试验在2017年21株mcr-1基因阳性耐黏菌素大肠埃希氏菌中共检测到12种类型质粒，以IncFII为主，为80.95%；在2020年13株mcr-1基因阳性耐黏菌素大肠埃希氏菌中共检测到7种类型质粒，以IncFII和IncFIB为主，均为92.31%。结果表明，2020年菌株携带质粒复制子类型虽少于2017年，但每株菌都至少携带两种类型质粒复制子，可见其所携带质粒复制子的多样性。2020年与2017年相比，IncI2型质粒的检出率有所增加，IncI2质粒在携带mcr基因的相同的移动元件上还携带其他耐药基因，如blaCTX-M，并且质粒可以通过使用阿莫西林等β-内酰胺类抗生素(目前仍广泛用于动物)进行广泛传播[22]。质粒也是基因水平转移(horizontal gene transfer，HGT)的重要媒介，由于它们在HGT中的作用，特别是在抗菌耐药性的出现和传播方面，细菌质粒的鉴定和分类受到了广泛关注，质粒复制子分型试验可提供有关抗生素耐药质粒家族在不同环境下在肠杆菌科中传播的进一步信息。

综上所述，虽然我国已经在禽畜饲养过程中限制使用黏菌素类抗菌药物，mcr-1基因阳性大肠埃希氏菌检出率以及耐黏菌素大肠埃希氏菌的分离率有所降低，但吉林省长春市畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌多重耐药情况严重，质粒类型复杂多样，并且由于畜禽源耐黏菌素大肠埃希氏菌的耐药基因可能会通过直接接触食物和水等方式直接或间接传播给人类，对于黏菌素耐药菌的潜在危害性仍然不容小觑，应当对畜牧养殖业做定期监测，正确使用抗生素药物及用量，避免多重耐药大肠埃希氏菌的广泛传播，危害人类健康。