不同助剂对莫西克汀浇泼剂工艺及体外透皮吸收的影响

杨志远，王存才，马丹阳，王金泉，赵红琼，郝智慧*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学动物医学学院，中兽医药创新中心，北京海淀 100193)

寄生虫病是当前宠物疾病中最主要的一类疾病，现有大量的药物应用于宠物寄生虫病的临床治疗[1]。主要驱虫药物有伊维菌素类、阿维菌素类、左旋咪唑、吡喹酮、莫西克汀[2-5]等，莫西克汀作为新兴抗寄生虫，具有广谱、高效、低毒、对环境无污染等优点[6]，目前我国已批准了莫西克汀浇泼剂在奶牛方面的应用[7]，还尚未有在宠物上作为浇泼剂应用的研究。

市面上的驱虫药剂型有很多种，例如片剂、注射剂和滴剂等，但目前并没有宠物方面的浇泼剂型，本试验根据宠物用药的安全性高、透皮吸收迅速、对宠物皮毛无影响等要求，对莫西克汀浇泼剂进行探究。通过对不同助剂筛选；通过高效液相色谱法测定莫西克汀的含量；通过进行大鼠离体皮肤透皮吸收试验，并按照药品稳定性指导原则进行初步稳定性考察。为开发针对犬用高效、安全的浇泼剂产品提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性SD大鼠，质量为(160±20)g，来源于斯贝福生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 莫西克汀(moxidectin)原料(>99%)，安徽新宇药业公司惠赠；中链甘油三酸酯、棉籽油、石蜡油、大豆油，特丁基对苯二酚(tert-butyl hydroquinone，TBHQ)、叔丁基羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole，BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)、肉豆蔻酸异丙酯、聚异丁烯(分子量1300)、聚异丁烯(分子量2400)，均为上海源叶生物科技有限公司产品；二乙二醇单乙醚，嘉法狮上海贸易有限公司产品；氮酮、二甲基亚砜、合成蜂蜡、色谱级乙腈、色谱级甲醇、无水乙醇，均为国药集团化学试剂有限公司产品；油溶紫、靛蓝胭脂红、柠檬黄，均为辽宁库克生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 高效液相色谱仪(安捷伦1260)，美国安捷伦公司产品；磁力搅拌器(WH220-HT)，WIGGENS THE MAGIC MOTION公司产品；智能透皮扩散仪(TP-6)，天津市精拓仪器科技有限公司产品；十万分之一电子天平(BT 125D)，sartorius公司产品；千分之一天平(ME203)，METTLER TOLEDO公司产品；旋转粘度计(NDJ-8S)，上海平轩科学仪器有限公司产品；综合药品稳定试验箱(型号LHH-250GSP)，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 溶剂的筛选 通过性状、溶解性、安全性和稳定性对溶剂进行综合筛选，测定溶剂对莫西克汀的溶解度，确定最终的溶剂。称取等量且过量的莫西克汀分别加入到含10 mL中链甘油三酸酯、棉籽油、液体石蜡、大豆油的烧杯中，在300 r/min、25℃条件下溶解24 h后，通过HPLC检测，得到莫西克汀在不同溶剂中的饱和溶解度[8]。

1.2.2 抗氧化剂的选择 分别称取等量的莫西克汀和3种不同抗氧化剂溶解到10 mL棉籽油中，在相同条件下搅拌至完全溶解。在第0、5、10天检测溶液中莫西克汀的含量变化，筛选出最适抗氧化剂。参考贾善考[9]在艾普利诺菌素浇泼剂中抗氧化剂用量。分别将20 mg、30 mg和50 mg的抗氧化剂加入到浇泼剂中，并在第0、5、10天用HPLC检测莫西克汀的含量变化，确定抗氧化剂的最佳剂量。

1.2.3 黏合剂的筛选 浇泼剂需要对动物的皮肤具有一定黏附作用，根据黏合剂的溶解性、稳定性、黏附性等确定最终的黏合剂。分别使用不同分子质量的聚异丁烯(1300、2400)、合成蜂蜡、空白棉籽油进行浇泼剂制剂，最终选择最适的黏合剂。

1.2.4 指示剂的筛选 通过着色能力、耐热性能和脂溶性、稳定性对指示剂进行筛选。

1.2.5 正交设计工艺优化 选用L9(34)正交试验法确定处方的最佳工艺。每个因素3个水平，工艺温度为(A)、搅拌速度为(B)、溶剂使用量为(C)3个因素(因素水平见表1)。以含量变化和粘度为考察指标进行评分[10]。最终得到的最佳处方工艺。

1.2.6 检测条件 色谱柱：岛津InertSustain C18(4.6 mm×250 mm，粒径5 μm)；柱温：35℃：进样量10 μL；检测波长：242 nm；流动相：C为乙腈，D为乙酸铵，用乙酸调pH至4.2；总时长20 min；流速：2 mL/min(参照农业部公告2168号公告)。

1.2.7 标准曲线的建立 精密称取500 mg莫西克汀到100 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得5000 μg/mL浓度的母液。吸取适量的母液配制成5、25、50、100、150、200 μg/mL的标准溶液，使用HPLC检测。

1.2.8 透皮吸收试验 采用简单扩散小室法进行透皮吸收试验。选择肉豆蔻酸异丙酯为促透剂[11]，分别制备含5%(批次1)、8%(批次2)、15%(批次3)、30%(批次4)肉豆蔻酸异丙酯的Moxidectin浇泼剂，检测不同批次制剂的透皮渗透性。准确吸取1 mL浇泼剂放入供给池，以10 mL的乙醇：生理盐水(4∶6)作为接收液放入接收池。分别在2、4、6、8、10、12、24 h从接收池取样2 mL，取样后立即补充等量接收液，将样品放于-20℃中保存，直到进行HPLC检测。用 HPLC 法测定Moxidectin浇泼剂的累积渗透量，并绘制24 h累计渗透量的渗透曲线，选择出最适的透皮吸收剂用量。渗透量公式如(1)所示：

(1)式中，Qn.t时间内药物的单位面积累积透过量(μg/cm2)；A.渗透面积(2.80 cm2)；Cn.t时间浓度测量值；Ci.t时间以前浓度测量值；V.接受液总体积(6.5 mL)；Vo.每次取样体积(22.0 mL)。

1.2.9 稳定性考察 取自制本品4批，在(40±2)℃，相对湿度(75±5)%的条件下放置6个月，分别于0、1、2、3和6个月取样，按中国兽药典规定的加速试验考察项目检测[12]。

1.2.10 数据的处理与分析 使用GraphPad Prism 8.0软件对试验结果进行分析处理。试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，单因素方差分析检验实验组差异性。正交试验助手V3.1对正交结果进行分析。

2 实验结果

2.1 助剂的确定

2.1.1 溶剂的确定 结果如图1所示，莫西克汀在不同溶剂中溶解度大小为中链甘油三酸酯>棉籽油>大豆油>液体石蜡。因为中链甘油三酸酯与染料油溶紫互不相溶，棉籽油比大豆油和液体石蜡溶解度更大，因此选择溶解度较高的棉籽油作为溶剂。

图1 莫西克汀在不同溶剂中的溶解度

2.1.2 抗氧化剂及剂量的确定 结果见图2，A为抗氧化剂的选择，B为抗氧化剂用量对比。图A显示在第0天时，空白组与试验组之间无显著性差异(P<0.05)；在第5天和第10天时，空白组与试验组出现极显著性差异(P<0.001)。且在第10天时，特丁基对苯二酚与叔丁基羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯均出现显著性差异(P<0.01)，表明特丁基对苯二酚比其他抗氧化剂抗氧化性更强。

图2 抗氧化剂及其剂量筛选

图B显示在第0天时，空白组与各试验组之间无显著性差异；而在第5天和第10天时，出现了极显著性差异(P<0.001)。在第5天与第10天时，3 mg/mL组和5 mg/mL组与2 mg/mL组之间均出现显著性差异(P<0.01)，而3 mg/mL与5 mg/mL组之间无显著性差异(P<0.05)，因此选择3 mg/mL作为抗氧化剂的使用量。

2.1.3 黏合剂的确定 图3显示了3种黏合剂的不同黏度：聚异丁烯(1300)>聚异丁烯(2400)>合成蜂蜡>空白组。其中聚异丁烯与合成蜂蜡黏度差异较大，聚异丁烯(1300)比聚异丁烯(2400)更稳定，因此选择了聚异丁烯(1300)作为黏合剂。

图3 不同黏合剂的粘度对比

2.2 正交试验结果

由表2中的R值可知，浇泼剂工艺影响因素大小依次为聚异丁烯用量>工艺温度>搅拌速度。表3结果显示，聚异丁烯(1300)的使用量对于浇泼剂的影响有显著性影响，搅拌速度对浇泼剂影响不明显。因此，浇泼剂的最佳工艺为聚异丁烯10%、温度30℃、搅拌速度400 r/min。

表1 正交筛选工艺优化

表2 正交试验结果

表3 方差分析

2.3 莫西克汀含量的标准曲线

图4为莫西克汀含量测定的标准曲线。其回归方程为y=12.407x+26.027 (R2=0.999 4)，说明莫西克汀在5 μg/mL～200 μg/mL的范围内有良好的线性关系。

图4 莫西克汀含量的标准曲线

2.4 透皮吸收剂的确定

图5表明，不同比例的肉豆蔻酸异丙酯对莫西克汀体外经皮透过性具有不同的效果。其中批次4与批次3释放速率过快，批次1释放速率较慢，批次2释放速率适中且渗透性良好，因此，8 %肉豆蔻酸异丙酯为最佳用量。

图5 浇泼剂渗透曲线图

2.5 稳定性考察

表4为加速试验结果，不同批次的样品经加速试验(6个月)后，其外观与表征等均无明显变化，莫西克汀的含量变化均在质量标准的规定范围内，表明本制剂稳定性良好。

表4 加速试验

3 讨论

莫西克汀作为一种新的抗寄生虫药，具有低毒、高效等优点，尚未发现其耐药性方面的报道[13]。与固体制剂相比，莫西克汀液体制剂拥有更高的生物利用度[14]。本试验的主要目的是制备一种宠物专用的莫西克汀浇泼剂，对莫西克汀的制剂进行创新，以解决宠物浇泼剂的制备问题。如何选择莫西克汀浇泼剂的辅料，是本试验的关键因素。由于莫西克汀是高脂溶性(logP为5.3～5.67)低水溶性(0.005 2 mg/kg)药物，根据相似相溶原理，选择对皮肤无刺激且具有一定增黏作用的棉籽油作为溶剂[15]。此外，棉籽油本身含有高浓度的维生素E和脂肪酸，可进一步增加药物的通透性和抗氧化能力[16]。

因为试验中的使用的抗氧化剂特丁基对苯二酚(TBHQ)具有一定的耐高温与抗菌作用，并且有文献证明其在植物油中添加0.01%～0.03%的量，其效果比叔丁基羟基茴香醚(BHA)和二丁基羟基甲苯(BHT)效果更优[17]，抗氧化能力更强，所以选择效果更好的抗氧化剂特丁基对苯二酚。试验中的聚异丁烯不但具有粘附作用，而且对药物有一定的缓释作用[18]，故现择其作为浇泼剂的黏合剂。肉豆蔻酸异丙酯作为亲脂性渗透促进剂[19]，它的安全性和有效性[20]可促进多种皮肤渗透或多种皮肤渗透活性化合物[21]；最终通过大鼠透皮试验证明了其具有良好的透皮吸收性。油溶紫作为着色剂其不溶于水，着色能力强，耐热性能较好；油溶紫在一定浓度的酸碱中可实现可逆变色，经处理过的油溶紫在一定温度下可实现可逆变色。与普通结晶紫内酯相比,具有优良的油溶性，因其具有一定指示性，同时也不会影响宠物的毛色，故选择其作为着色剂[22]。

本试验制备成功筛选出浇泼剂所需的各种辅料，并完成了莫西克汀浇泼剂的制备，加速试验证明其制剂稳定，完成了宠物浇泼剂工艺的初步探究。为未来从事浇泼剂研究的工作者们提供试验与理论根据，为莫西克汀浇泼剂在宠物方向的制备应用开辟了新的前景。