EDTA对黏菌素体外抗菌活性的影响

刘小康,李帅华,张梦珂,潘玉善,刘建华,苑 丽,胡功政

(河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 450000)

黏菌素(Colistin)是一种阳离子多肽类抗生素,又名多黏菌素E,是人医临床、兽医临床上常用的抗菌药物。黏菌素因其肾毒性作用大,在20世纪80年代早期曾被世界大多数地区弃用。然而多重耐药菌的出现以及对革兰氏阴性微生物有活性的新抗菌药物的缺乏,黏菌素作为治疗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线,被重新应用于治疗多重耐药的阴性菌感染[1]。黏菌素的抗菌机理是通过分子中的聚阳离子环与细菌细胞外膜上类脂A作用,置换外膜中的钙和镁等阳离子,破坏阴性菌带负电荷的外膜而降低细胞膜的稳定性,使细胞内重要物质外流从而产生杀菌作用[2]。然而自2015年由质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1首次被报道以来,又相继在中国或其他国家分离的肠杆菌科细菌中检测出了mcr-2～mcr-10等9种新的mcr基因亚型[3-6]。mcr基因随着可移动质粒在不同物种不同菌属之间的水平传播,显著加快了黏菌素抗性的传播速度,给畜牧业及人类健康带来了严重威胁。

除了上述重要的耐药机制外,外排泵和外膜的屏障作用是引起黏菌素抗性的非特异性因素[3],故寻求有效的外排泵抑制剂或膜通透性促进剂,是增强黏菌素抗菌活性或增强细菌黏菌素敏感性的有效策略。外排泵抑制剂如氰氯苯腙(CCCP)、2,4—二硝基酚(DNP)和利血平等由于自身的毒性作用,限制了其在临床上的应用[7]。EDTA作为二价阳离子的螯合剂,被证实可通过竞争性结合与外膜脂多糖静电相连的Ca2+和Mg2+,使外膜的稳定性减弱,并在介质中释放脂多糖,最终增加革兰氏阴性菌的外膜通透性[8]。据Banin E等[9]报道，与EDTA联用时庆大霉素对铜绿假单胞菌的杀灭效果可达1000倍以上。尽管EDTA作为膜通透性促进剂,已被证实增强了多种抗菌药物的活性[10,11],但关于EDTA对肠杆菌科细菌的黏菌素敏感性的影响尚未见研究报道。本研究选定从猪和鸡中分离的沙门菌、大肠杆菌,从表型上观察了膜通透性促进剂 EDTA对黏菌素作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 51株沙门菌和34株大肠杆菌,以及临床分离的黏菌素天然耐药菌奇异变形杆菌3株和摩氏摩根菌1株(对照菌),均是由本实验室保存的经过鉴定的临床分离菌株。鼠伤寒沙门菌标准株CVCC®541(命名为JS),购自中国兽药监察所;质控菌株为大肠埃希菌ATCC®25922,购自中国普通微生物菌种保存中心。

1.1.2 药品储备液的制备 黏菌素(效价为23988 U/mg,购于河北圣雪大成唐山制药有限责任公司):用无菌去离子水配成5120 mg/L的储备液。乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na):用无菌去离子水配成5000 mg/L的储备液。以上储备液均要过滤除菌,置于-20 ℃保存备用。

1.1.3主要试剂及培养基 琼脂糖(Takara,Japan)、2×Taq Master Mix酶、DM2000 DNA Marker (Takara, Japan)、TE缓冲液和荧光染料溴化乙锭EB均购于上海生工生物技术服务有限公司; LB肉汤、LB琼脂、MHB肉汤、麦康凯琼脂和SS琼脂,均购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的复苏 将保存在-80 ℃的甘油菌取出,融化后上下颠倒摇匀,吸取100 μL接种于4 mL新鲜LB肉汤培养基,于37 ℃培养过夜。用接种环蘸取适量，在麦康凯或SS琼脂培养基上划线,于37 ℃培养16～18 h,再挑取单菌落接种到4 mL LB肉汤中。将纯化后的临床菌置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2mcr基因的检测 采用煮沸法提取基因组DNA,参考有关文献报道的mcr基因引物[4-6,12-14],通过PCR扩增和测序分析检测质粒介导的黏菌素抗性基因mcr-1～mcr-10。

1.2.3 EDTA对黏菌素MIC的影响 参照CLSI规定的操作方法[15],使用二倍微量肉汤稀释法分别测定黏菌素和EDTA对受试菌株的最小抑菌浓度(MICs)。再测定亚抑菌浓度(sub-MIC)的EDTA存在时黏菌素对各菌株的MIC。以黏菌素天然耐药菌奇异变形杆菌、摩氏摩根菌和沙门菌(标准菌株JS)为对照。以大肠杆菌ATCC®25922作为质控菌株。试验重复3次。

1.2.4 体外杀菌曲线 选择3株代表性沙门菌(标准菌株JS、临床分离的鸡源耐黏菌素沙门菌CS23和CS18),分别测定1/2MIC的黏菌素、sub-MIC的EDTA、1/2MIC的黏菌素+sub-MIC的EDTA的杀菌作用,分别在0、2、4、6、8、16和24 h取样,涂板,置37 ℃恒温培养箱培养12 h后计数,测定活细胞数,绘制体外杀菌曲线。试验重复3次。

1.2.5 统计学分析 通过方差分析对EDTA作用前后黏菌素的MIC进行差异显著性评估,当P值<0.05时被认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 质粒介导的黏菌素耐药基因

在85株临床分离的沙门菌和大肠杆菌中,只检测到mcr-1基因,扩增片段长度为1626 bp,与预期大小相符(图1)。其中沙门菌和大肠杆菌中的mcr-1阳性菌株分别有12株和11株(表1),检出率总计为27.1%(23/85)。没有检测到mcr-2～mcr-10的阳性菌株。

M: DNA分子量标准;1～4:临床分离株的PCR产物;N:阴性对照;P:阳性对照。图1 部分mcr-1基因的凝胶电泳结果

2.2 药敏试验结果

黏菌素对沙门菌、大肠杆菌的MIC范围见表1。根据CLSI规定的折点,以黏菌素MIC≥4 mg/L标准判定为耐药[15]。对照菌3株奇异变形杆菌和1株摩氏摩根菌对黏菌素天然耐药(MIC>512 mg/L)。沙门菌的MIC最高达64 mg/L,其MIC50为1 mg/L,MIC90为32 mg/L。大肠杆菌的MIC范围为0.5～32.0 mg/L,其MIC50、MIC90分别为0.5、8.0 mg/L.

表1 mcr-1检出情况以及黏菌素对受试菌株的MIC值

表2展示了黏菌素及其与sub-MIC的EDTA联用时,对临床分离菌及对照菌株的抗菌活性。沙门菌和大肠杆菌对黏菌素的耐药率分别为37.3%(19/51)、29.4%(10/34),耐药率总计为34.1%(29/85)。EDTA对受试菌株的MIC范围在125～500 mg/L,表明其体外抑菌作用十分微弱。黏菌素联合EDTA后,对沙门菌和大肠杆菌的MIC不同程度地下降,但对奇异变形杆菌和摩氏摩根菌的MIC没有变化。其中,60 mg/L的EDTA对沙门菌和大肠杆菌黏菌素耐药率的影响有一定的差异,此浓度的EDTA使大肠杆菌的耐药率从29.4%降低至2.9%,逆转了9株大肠杆菌对黏菌素的抗性,但仅逆转了5株沙门菌对黏菌素的抗性,使其耐药率从37.3%降低至27.5%。方差分析结果显示，在EDTA作用前后,黏菌素对分离菌的MIC存在显著差异(P<0.001)。经30 mg/L的EDTA作用后,统计结果显示P值为0.00439,说明此EDTA浓度对黏菌素的抑菌活性仍有一定的增强作用。15 mg/L EDTA对大部分菌株的MIC基本上不产生影响。联合EDTA后，黏菌素对沙门菌标准株JS的MIC降低了2～4倍。由此可见,EDTA对黏菌素的MIC的影响呈浓度依赖性,≥30 mg/L的EDTA可增强除天然黏菌素耐药菌株之外的临床分离菌株和标准菌株对黏菌素的敏感性。

表2 黏菌素单用及与不同浓度的EDTA联用对临床分离株和标准株的抗菌活性

2.3 体外杀菌曲线结果

对标准株JS(MIC=1 mg/L)、耐黏菌素的mcr-1阳性菌株CS23(MIC=32 mg/L)和mcr-1阴性菌株CS18(MIC=32 mg/L),分别测定黏菌素(1/2MIC)、EDTA(sub-MIC)及两药联合的杀菌作用。结果见图2。在黏菌素单独作用的前4 h内,3株菌的活菌数均不同程度地下降,然后开始上升,第8 h后生长速度变慢,最后逐渐趋于平稳。单独使用EDTA基本上没有抑菌作用,供试菌株的生长趋势与只有细菌的对照组的生长趋势基本一致。当黏菌素存在时,EDTA的加入显著影响了细菌的生长,对于JS和CS18,如图2a和图2b所示,在第2 h附近,活菌数处于最低水平,但之后均开始增加,其中JS在第4 h恢复至单独黏菌素作用的水平,而CS18则直至第24 h才恢复至单独黏菌素作用的水平。对于CS23,如图2c所示,黏菌素联合EDTA后,活菌数始终低于单独黏菌素作用组,在第8 h后,呈现下降趋势,且在第8、16 h,活菌数分别比单独黏菌素组降低了2和4 log cfu/mL,说明EDTA显著增强了黏菌素对此菌株的杀菌作用。

图2 黏菌素、EDTA及两者联用对菌株JS、CS18和CS23的体外杀菌曲线

3 讨论与结论

近年来,因用于治疗革兰氏阴性菌感染的碳青霉烯类、头孢菌素类和氟喹诺酮类等抗菌药物的耐药性普遍提高,黏菌素作为治疗革兰氏阴性菌感染的最后手段被广泛应用,这使得耐黏菌素的细菌菌株不断被检出[16]。本研究报道的85株临床分离的沙门菌和大肠杆菌中,对黏菌素的耐药率分别为37.3%(19/51)、29.4%(10/34),mcr-1的阳性率为27.1%(23/85),未检出mcr-2～mcr-10基因。在23株mcr-1阳性菌株中,有3株对黏菌素不耐药,说明mcr-1可能在这些菌株中没有表达或低表达。除此之外,仍有9株mcr-1阴性菌株对黏菌素耐药,说明除了质粒介导的mcr-1外,其他机制如染色体介导的或非特异性耐药机制也发挥着重要作用。在质粒介导的mcr基因被报道以前,染色体介导的双组分信号转导系统被认为是介导黏菌素耐药的主要机制,这一机制是由相关基因如pmrAB、phoPQ、mgrB和pmrD等发生突变或表达量变化而引起外膜类脂A的糖化(Ara4N化)或乙醇胺化(pETN化)修饰,继而使LPS的负电荷减少,最终导致阳离子黏菌素与细菌外膜阴性LPS的亲和力降低,使细菌耐药[17]。

本研究的联合药敏试验结果表明,对于黏菌素天然耐药菌奇异变形杆菌和摩氏摩根菌,联用sub-MIC的EDTA对黏菌素的MIC不产生影响,这可能与菌株天然耐药的不同机制有关。但有效的EDTA浓度可使黏菌素对大肠杆菌和沙门菌的MIC降低,导致菌株的耐药率下降,且无论对于质粒介导的黏菌素抗性菌株还是由其他机制介导的黏菌素抗性菌株,EDTA均可增强其对黏菌素的敏感性,这可能是因为EDTA螯合Ca2+与Mg2+引起的外膜解离和渗透作用增强了药物的抗菌效力[8],其具体分子机制有待研究。本试验结果表明:EDTA浓度越高，其增效作用越强,其增强黏菌素抑菌活性的作用呈现浓度依赖性。体外杀菌曲线表明:黏菌素联合EDTA后,细菌的生长受到明显抑制,虽然抑制程度在不同菌株之间存在一定差异,但仍能清楚地证实EDTA可增强黏菌素对分离菌株的抗菌活性,且对mcr-1阳性和mcr-1阴性菌株的作用相同,表明其作用不受不同获得性耐药机制的影响。统计学分析结果显示:60 mg/L或30 mg/L的EDTA作用前后,黏菌素对受试菌株的MIC差异显著。说明≥30 mg/L的EDTA可有效增强黏菌素的抗菌活性。EDTA对黏菌素抗菌活性的增强也表明:外膜屏障作用介导的非特异性耐黏菌素机制可能占据着不可或缺的地位,与质粒介导的mcr-1或染色体介导的双组分系统共同导致了菌株对黏菌素的高水平耐药。

随着多重耐药菌株的不断增加,单一抗菌药的疗法也面临着巨大挑战,因此使用抗菌药与抗菌增效剂结合的疗法可在一定程度上缓解日益严重的耐药问题,从而进一步增强抗菌药物的疗效。本研究从表型上证实了EDTA可增强不同耐药机制的沙门菌和大肠杆菌对黏菌素的敏感性,为临床上潜在药物如EDTA的应用提供了重要参考,但还需要进一步的研究来探索EDTA在体内的剂量和安全性。