UPLC-MS/MS法测定猪肉及其制品中己烯雌酚残留量

孙亚南，李媛

陕西省产品质量监督检验研究院（西安 710048）

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是人工合成的非甾体雌性激素类药物，因其能够提高动物日增重和减少脂肪、促进蛋白质代谢合成、提高饲料转化率、在动物的促生长和育肥方面具有较好效果，常被作为生长促进剂用于畜牧养殖业中[1-5]。然而，随着己烯雌酚在动物体内的残留累积，此类动物源性食品被人食用后会对肝、肾等内脏造成损害，破坏机体遗传物质，导致基因突变[6]，对人体健康和生态环境均会造成严重危害[7-8]。2019年12月27日，我国农业农村部发布的第250号公告明确规定将己烯雌酚纳入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单中[9]。己烯雌酚的检测和监控对于保障相关畜禽类食品质量安全和人民生命健康具有重要意义。

已报道的有关动物源性食品中己烯雌酚的分析检测方法主要有LC法、LC-MS法、HPLC法、HPLC-MS和免疫分析法等检测方法[5,10-14]。其中，HPLC在提高分析灵敏度、重现性及其广适性方面具有明显优势，故而成为科研工作者的首选。

试验以叔丁基甲醚为提取剂，采用同位素内标法定量，建立猪肉中己烯雌酚的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，为猪肉及其制品中己烯雌酚的快速测定提供有效方案。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材

猪肉样品（市购）；猪肉粉质控样（编号PKL04011305970B，广州谱恩科学仪器有限公司）；己烯雌酚标准物质[编号GBW（E）083491，北京北方伟业计量技术研究院]；己烯雌酚-8氘代标准物质（货号CCAD300663，美国CATO公司）；甲醇、乙腈、正己烷、叔丁基甲醚（均为色谱纯）；超纯水（优普系列超纯水机制备）；Waters OasisTMHLB固相萃取柱（SPE柱，500 mg，6 mL，美国Waters公司）。

1.2 仪器与设备

1260-6420高效液相色谱-质谱串联仪（美国Agilent Technologies公司）；Vortex-Genie 2涡旋混合器（Scientific Industries公司）；FV64全自动智能氮吹仪（得泰仪器科技有限公司）；氮气发生器（Peak Scientific Instruments公司）；EXTRA全自动SPE（上海屹尧仪器科技发展有限公司）；BSA224S分析天平[赛多利斯科学（北京）公司]；H1750R高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取

准确称取2 g（精确到0.01 g）匀浆后的猪肉样品于50 mL聚丙烯带盖离心管中，加入100 μL的己烯雌酚-D8标准物质（1 μg/mL），加6 mL叔丁基甲醚提取液，涡旋1 min，振荡10 min，于-4 ℃，6 000 r/min离心5 min，上清液全部转移至另一个50 mL聚丙烯带盖离心管中，向残渣中加入6 mL叔丁基甲醚，按上述过程重复提取1次，合并2次提取液并充分混匀后，于40 ℃全部氮吹至干，加入2 mL 80%乙腈溶液，涡旋30 s使残留物复溶，加入5 mL正己烷，涡旋混匀后于3 000 r/min离心5 min，取下层溶液待净化。空白试验除不加试样外其余同上。

质控样提取过程：称取0.5 g（精确到0.01 g）猪肉粉质控样，用1.5 mL水溶解复原，涡旋混匀，其余过程同上。

1.3.2 样品净化

SPE柱临用前分别用3 mL叔丁基甲醚、3 mL甲醇和3 mL水预处理，保持柱体湿润。将上述处理得到的下层待净化提取液全部转移至预处理过后的HLB固相萃取柱，以每3～4 s/滴的流速通过SPE柱，依次用甲醇-水（3∶7，V/V）、水、甲醇-2%氨水（1∶9，V/V）溶液各3 mL淋洗，弃去洗液，抽干。用7 mL甲醇-叔丁基甲基醚（1∶9，V/V）溶液洗脱，收集所有洗脱液，于40 ℃氮吹至干，准确加入2 mL 80%乙腈溶液溶解残余物，充分涡旋，过0.22 μm有机滤膜，滤液供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 标准溶液的配制

用乙腈分别将己烯雌酚标准物质及其同位素内标己烯雌酚-D8配制成10 μg/mL的储备液（-18 ℃保存），然后将储备液用乙腈精确稀释成1 μg/mL的中间液；分别准确移取适量的储备液和中间液至10 mL容量瓶中，加入50 μL/mL同位素内标（中间液1 μg/mL），用乙腈定容至刻度，配制的己烯雌酚质量浓度依次为5，10，20，50，100，200，500和1 000 ng/mL，其中己烯雌酚-D8质量浓度为50 ng/mL。

1.5 液相色谱-串联质谱条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18型（2.1 mm× 100 mm，2.7 μm）；柱温35 ℃；流动相A为乙腈，流动相B为水；梯度洗脱程序：0～1.0 min、10% A，1.5～5.0 min、90% A，5.5～6.0 min、10% A；流速0.3 mL/min；进样体积10 μL。

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）负离子模式；多反应监测（MRM）扫描方式；毛细管电压4.0 kV（ESI-）；碎裂电压140 V；干燥气温度320 ℃；干燥气流速13.0 L/min；雾化气压力206.9 kPa（30.0 psi）。

2 结果与讨论

2.1 试验条件优化

图1为DES及其内标的标准溶液总离子流图谱（标准物质质量浓度100 ng/mL、内标质量浓度20 ng/mL）。可以看出DES在该试验条件下具有较好的分离度且响应值满足信噪比要求，液相条件和质谱条件均能满足后续试验要求。

图1 标准物质及内标总离子流图谱

2.1.1 前处理方法选择

分别考察采用2种不同前处理方法对质控样品和空白样品中添加水平为50 μg/kg（加标1）及100 μg/kg（加标2）的回收率情况，结果如图2所示。方法1[15]是将样品在乙酸钠缓冲溶液中酶解后经乙腈提取，无水硫酸钠除水，经QuEChERS吸附剂1净化，浓缩复溶，因酶解过程耗时且提取净化操作步骤繁琐，增加己烯雌酚的损失，致使其回收率相对较低。方法2为试验中的处理方法，均质样品经叔丁基甲醚振荡提取，冷冻离心，经正己烷除脂，SPE小柱净化，大幅降低基质效应，该方法简单高效，提取效果良好，目标物损失相对较少。试验方法回收率明显高于方法1。

图2 2种不同前处理方法的回收率对比

2.1.2 提取剂选择

相关文献报道的关于动物源性食品中己烯雌酚的测定前处理方法主要采用乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚等作为提取溶剂[16-18]。试验考察乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚对DES的提取效率。图3为猪肉空白样品、加标样品和猪肉粉质控样的MRM图谱。结果表明：以乙腈作为提取剂的质控样品和加标样品未检测到目标物的特征峰；乙酸乙酯在提取DES的同时也萃取脂溶性杂质，使得样品基质较为复杂，导致后续净化困难，回收率低；相较之下，叔丁基甲醚提取率良好，在三者中的回收率最高，质控样品和空白加标试验的回收率均超过85%。故试验选择叔丁基甲醚作为提取试剂。

图3 空白猪肉样品（A）、加标猪肉样品（B）（加标量50.0 μg/kg）和猪肉粉质控样（C）的MRM图

2.2 绘制标准曲线

试验结果表明己烯雌酚在5～1 000 μg/kg的质量分数范围内与其质谱响应值呈现良好线性关系，其中：在5～100 μg/kg质量分数范围内的线性方程为y= 0.041 0+0.537 1x，R2=0.998 7；在100～1 000 μg/kg质量分数范围内的线性方程为y=0.027 4+1.543 4x，R2= 0.999 6。其中，x表示目标待测物的相对浓度，y表示其对应的相对响应值。

2.3 准确度和精密度

以己烯雌酚阴性猪肉样品作为基质，分别对10，50，100和500 μg/kg 4个添加质量分数按照上述试验过程进行加标回收试验，进行7次平行测定，该方法的回收率在86.3%～107.6%，SRSD在2.6%～12.4%。在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的20%。

3 结论

试验通过对样品前处理改进和仪器分析方法的优化，采用叔丁基甲醚作为提取剂，建立特异性的分析方法，实现对质控样品及空白加标样品中己烯雌酚的测定。相比于国内通用的检测方法，试验在满足对回收率和精密度要求的前提下，不需要酶解过程，很大程度上简化试验步骤，大幅缩短前处理时间，且内标损失相对较小，有效提高回收率。该方法操作简单、耗时短、回收率高、准确性好、检测成本低，为快速检测动物性食品中己烯雌酚提供有效的方法选择。