超声波-酶辅助提取黑布林果皮色素及其抗氧化性研究

高红芳

渭南职业技术学院（渭南 714026）

食用色素作为一种添加剂，在丰富食品颜色、增强食欲、刺激消费者购买欲等方面起着重要作用。食用色素主要分为合成色素和天然色素，大多数合成色素会对人体健康和公共健康产生不利影响[1]，因此，利用动植物资源开发天然色素成为重要研究方向。

植物中色素的提取是一种涉及传质的固液浸出过程。由于色素与植物细胞膜紧密结合在一起，传统溶剂浸渍提取法非常耗时，而且需要相对大量的溶剂。因此，在传统溶剂提取的基础上，通过一些先进的技术手段更能对色素进行有效提取，如连续加压法[2]、超临界流体萃取法[3]、微波辅助提取法[4]等。与这些提取技术相比，超声辅助提取技术在实际操作中成本低、操作简单，被广泛应用于色素提取[5]。张晓旭等[6]研究结果表明，与传统有机溶液浸提法相比，超声辅助提取法可以明显提高青花椒色素提取率。刘颖等[7]研究发现，相比传统浸提法，超声辅助提取法从黄花菜中提取叶绿素所用时间更短。其原因在于：一方面，超声波因其特有的空化作用，可使细胞组织变性，造成细胞壁快速破裂，有利于色素溶出；另一方面，超声波产生一种力学效应，可增加溶剂对原料的渗透及提取溶剂与物料间的接触面积，大幅提高提取效率[8]。

黑布林，也称美国黑李，是我国近年引进的丰产优质品种，果大核小，果皮呈紫红色，色素极其丰富，是良好的天然色素资源。黑布林果皮色素提取研究较少，仅用传统溶剂浸提法来提取[9]。试验在传统溶剂浸提基础上，采用超声-酶辅助技术提取黑布林果皮色素，对提取工艺进行优化，评价其抗氧化特性，并对色素在果冻中的应用特性进行初步探讨，为黑布林果皮色素的生产及在食品行业中的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑布林（渭南马寨村农户果园）；纤维素酶（南宁庞博生物工程有限公司）；果冻粉（上海枫未实业有限公司）；1, 1-二苯基-2-3硝基苯肼（DPPH，源叶生物科技有限公司）；溴化钾：光谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；抗坏血酸（国药集团化学试剂有限公司）。

TS-1000型电热鼓风干燥箱（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；HHW-2KV-660水浴锅（上海南荣实验室设备有限公司）；KS-500DE型数控超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）；UV-Power紫外可见分光光度计（北京莱博泰科仪器股份有限公司）；80-2型离心机（上海坤诚科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 黑布林果皮色素提取工艺流程及操作要点

1.2.1.1 工艺流程

黑布林→清洗→取皮→烘干→粉碎→提取→离心→色素液→真空旋转浓缩→低温干燥

1.2.1.2 操作要点

选取颜色均一、新鲜的黑布林，取果皮于50 ℃鼓风干燥箱内干燥24 h，用粉碎机粉碎，过0.180 mm（80目）孔径筛，未能过筛的较大颗粒2次粉碎后密封放置4 ℃密封保存。准确称取0.5 g粉碎的黑布林果皮置于锥形瓶中，按照料液比1∶100 g/mL加入超纯水，加入纤维素酶，酶解30 min，在超声波条件下进行提取。将粗提液倒入试管中，经4 000 r/min离心10 min后，吸取上清液，等体积稀释，测定在500 nm处的吸光度。

1.2.2 黑布林果皮色素溶液特征光谱的确定

取黑布林果皮色素提取液，适当稀释后用紫外可见分光光度计进行扫描，确定其最大吸收峰的位置。

1.2.3 黑布林果皮色素提取条件的选择

1.2.3.1 单因素试验

参照1.2.1.2小节操作要点，以吸光度为评价指标，分别考察酶添加量（0，0.2%，0.4%，0.6%和1%）、超声功率（50，60，70，80，90和100 W）及超声时间（20，30，40，50和60 min）对黑布林果皮色素提取液吸光度的影响。

1.2.3.2 正交试验

在单因素试验的基础上，以吸光度为指标，以酶添加量、超声功率和超声时间为考察因素，进行L9(33)正交试验，试验设计如表1所示，确定最佳提取工艺。

表1 正交试验因素和水平

1.2.4 提取率测定[10]

准确称取一定量干燥后的黑布林果皮粉末（m0），按照1.2.3.2小节确定的最佳提取工艺提取，离心收集滤液后，将滤液置于旋转蒸发仪，蒸发至提取液少量时即转入已知质量的烧杯（m1），将烧杯烘干至恒重，称量烧杯和提取物质量（m2），按式（1）计算提取率。

1.2.5 黑布林果皮色素红外光谱特征分析

黑布林果皮色素红外光谱特征分析采用溴化钾压片法。将适量黑布林果皮色素粉末与干燥后的溴化钾粉末混合后放入玛瑙钵中，充分磨细，在压片机上压片。在400～4 000 cm-1范围内测其红外吸收光谱，并进行分析。

1.2.6 黑布林果皮色素对DPPH·的清除作用[11]

取2 mL不同浓度的色素溶液及抗坏血酸溶液，分别加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液（无水乙醇配制），避光反应30 min，测定其在波长517 nm处的吸光度Ai，以无水乙醇代替DPPH·作为对照组，测定其吸光度Aj，并用超纯水代替色素溶液作空白组，测定其吸光度A0，按式（2）计算清除率。

1.2.7 数据处理

为保证试验精确度，每个水平进行3组平行试验，结果取平均值。采用SPSS 17.0统计分析软件进行方差分析，数据以均值±标准差表示。采用Origin 8.5软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 黑布林果皮色素最大吸收波长确定

提取的黑布林果皮色素经过滤、离心、稀释之后，在400～700 nm的扫描光谱如图1所示。试验提取的黑布林果皮色素最大吸收峰在500 nm处，与詹嘉红等[12]报道的黑布林果皮色素在510 nm处有最大吸收峰存在一定差异：一方面可能是由于所用原料不同，另一方面由于提取溶剂不同。

图1 黑布林果皮色素的吸收光谱

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶添加量对黑布林果皮色素提取的影响

由图2可知，纤维素酶添加量0～0.4%时，随着纤维素酶添加量增加，黑布林果皮色素提取液吸光度增加，且高于未添加纤维素酶时的吸光度。这是由于纤维素酶水解植物细胞壁，改变细胞壁的通透性，使组织细胞内含物与溶剂充分接触，增强了提取效果[13]。纤维素酶添加量0.4%时，吸光度达到最高，酶添加量继续增加时，吸光度下降，可能是由于底物浓度与纤维素酶量相比过低，使纤维素酶受到抑制，从而降低色素的提取效果[14]。

图2 纤维素酶添加量对黑布林果皮色素提取的影响

2.2.2 超声功率对黑布林果皮色素提取的影响

超声功率对色素提取效果的影响如图3所示。超声功率50～80 W时，随着超声功率增加，色素吸光度增加。超声过程中产生的机械效应会破坏细胞组织结构及状态。功率较小时，细胞破碎不完全，果皮色素未完全释放，随功率增大，超声波的空化效应和机械波动效应对细胞壁破坏作用增强，色素易析出，且超声的空化作用可增大分子的运动速度、增大提取溶剂的穿透力，使溶剂快速进入细胞组织，促进色素提取[15]。超声功率80 W时，色素吸光度达到最大值。随着超声功率继续增大，色素提取率下降，后趋于平稳。前人研究甜菜色素提取时中也发现同样规律，超声功率83 W时，甜菜色素的提取率最大，随着提取功率不断增加，提取率下降[16]。这可能是由于功率过大时，溶剂中的气泡在空化过程中不断增加，过多的能量会以热的形式散发，引起色素降解[17]。

图3 超声功率对黑布林果皮色素提取的影响

2.2.3 超声时间对黑布林果皮色素提取的影响

提取时间对色素提取效果的影响如图4所示。超声时间10～50 min时，随着超声时间的增加，色素吸光度随之增大。超声时间超过50 min时，吸光度稍有下降。超声提取能在较短时间内迅速将目标物提取出来，在超声波辅助提取色素的过程中，超声时间过长色素易发生降解且结构被破坏，导致吸光度降低。另外，超声时间过长，果皮色素易氧化分解，提取效果下降[18]。

图4 超声时间对黑布林果皮色素提取的影响

2.3 正交试验结果与分析

由表2中极差R值可知，黑布林果皮色素提取3个因素对提取效果存在不同程度影响，影响大小依次为C（超声时间）＞B（超声功率）＞A（酶添加量）。可见，最重要的影响因素是超声时间。由R值分析结果可知，黑布林果皮色素提取的最佳方案为A3B2C2。由于该组试验并未在正交试验表中，因此进行验证实验，得到吸光度值为0.572，略低于正交表中A1B2C2组合。因此，选择最佳的工艺条件为酶添加量0.2%、超声功率80 W、超声时间50 min。

表2 正交试验结果

2.4 最优工艺条件验证试验

为保证试验的准确性，在A1B2C2的工艺条件下进行3组重复试验，黑布林果皮色素的平均吸光度为0.580，与正交试验结果接近，证明正交试验结果可信。在该工艺条件下得到的黑布林果皮色素提取率为35.65%。

2.5 黑布林果皮色素红外光谱分析

黑布林果皮色素的红外光谱如图5所示。在3 411 cm-1处存在较强吸收峰，属于羟基的重要吸收峰，是由于O—H伸缩振动引起的，说明结构中有醇类、酚类或者有机酸。指纹区1 220 cm-1与1 080 cm-1分别为酚羟基及醇羟基C—O的伸缩振动吸收峰。1 718 cm-1为杂环中羰基C＝O的伸缩振动峰。1 624 cm-1为C＝C的变形振动吸收峰。1 402 cm-1为芳环的特征吸收峰，在867，777和815 cm-1出现一些弱吸收峰，主要是苯环取代面上C—H面外弯曲振动的吸收峰，说明存在各种类型取代结构芳环[19]。该色素存在的羰基、酚羟基、芳香环等结构对应花青素类物质的基本官能团，初步推测提取的黑布林果皮色素属于花青素类物质[20]。

图5 黑布林果皮色素红外光谱图

2.6 黑布林果皮色素DPPH·清除能力

不同浓度黑布林果皮色素对DPPH·的清除率如图6所示。黑布林果皮色素对DPPH·有一定的清除能力，且随着色素浓度提高，清除率增强。将黑布林果皮色素与VC对DPPH·清除能力进行比较，2 mg/mL黑布林果皮色素自由基清除率为80.8%，0.08 mg/mL VC自由基清除率为77.5%，可见，黑布林果皮色素DPPH·清除率相比VC较弱。但与从植物中提取的红蓝草红色素（质量浓度30 mg/mL，DPPH·清除率＜ 60%）相比，黑布林果皮色素表现出较强的DPPH·清除率[21]，这可能是由于黑布林果皮色素为花青素类物质。

图6 黑布林果皮色素与维生素C对DPPH·的清除能力

2.7 在果冻中的应用研究

将试验提取的黑布林果皮色素用于果冻的制作，果冻透亮，色泽均一，如图7所示。可通过改变黑布林果皮色素添加量对其呈现的颜色进行调整，色素添加量不同时，果冻呈现不同颜色。色素添加量0.25 mg/mL时，果冻呈水蜜桃粉色；添加量0.5 mg/mL时，果冻呈玫红色。该色素属天然植物色素，安全性高，有良好的水溶性，在不引起果冻风味、口感和质地改变的同时，可赋予果冻诱人的色泽，具有开发为天然食品色素的潜力。

图7 黑布林果皮色素对果冻的着色效果

3 结论

试验以水为溶剂，采用纤维素酶辅助超声波法从黑布林果皮中提取天然色素，确定黑布林果皮色素的最佳提取条件：纤维素酶添加量0.2%、超声功率80 W、超声时间50 min。按此条件提取的黑布林果皮色素的提取率为35.65%。通过红外光谱分析，推测该色素属花青素类物质，对DPPH·具有一定的清除能力。将该色素应用于果冻着色，不同色素添加量可使果冻呈现不同颜色，在实际生产中可根据需要选择合适的添加量对食品颜色进行调配。试验结果为黑布林果皮色素的工业化生产与应用提供一定理论支撑，能更好满足食品加工行业对天然色素的需求。试验只通过红外光谱分析黑布林果皮色素中可能存在的基团，后续研究尚需采用合适的方法对黑布林果皮色素进行进一步分离和结构确认。