微波辅助萃取法提取葛根总黄酮工艺优化

李东 ，姚氏丽，张小勤 *，蒋思峡 ，宋亚 ，喻仕瑞 *

1. 茅台学院食品科学与工程系（仁怀 564507）；2. 贵州保健酒酿造工程研究中心（仁怀 564507）

葛根（Radix puerariae）为豆科植物野葛的根，藤本植物，藤长可达10 m以上，根系发达，根粗大、肥厚，一般呈拳形、长圆形或纺锤形；外皮呈土黄色，肉呈白色，肉质坚韧，富含纤维素。葛根生长于我国南方地区山坡草丛中或路旁及较温暖阴湿处，素有“亚洲人参”的美誉，在我国有悠久的入药历史[1]。因其味道清甜爽口，一些地区也常把葛根作为蔬菜食用，属于药食两用天然植物资源[2]。世界上葛根约20余种，我国有10余种，其中以野葛和粉葛分布最广、产量最高，主要分布在广西、贵州、广东、湖南和四川等省份。广西是我国最大的粉葛产区，种植面积达10 201 hm2，加工企业10余家，产量近30万 t[3]。葛根中含有碳水化合物、蛋白质、膳食纤维等多种营养物质，及黄酮类、三萜类、生物碱类生物活性物质，此外还富含人体必需的多种氨基酸和微量元素等[4-5]。黄酮类物质达30余种，主要为葛根素、金雀异黄素、大豆苷、大豆苷元、染料木素和香豆素，其中葛根素是被研究最多的活性成分[6-7]。药食两用的特点使葛根具有极大的经济价值，其显著的药理价值和生理活性作用被广泛应用于医药工业、食品工业、日用化工等多个领域，且国内外市场对黄酮需求量逐步扩大[8]。

葛根中的黄酮类化合物为其主要的生理活性物质[2,9]，具有抑制体内活性氧自由基的产生、提高体内组织的抗氧化能力、修复细胞损伤、延缓和抑制细胞衰老、加速血液中酒精代谢及解酒护肝、预防心血管疾病等诸多生理功能[10-14]。葛根黄酮类化合物的提取方法主要有水煎法、加热回流法、酶解法和超临界流体萃取法[15-19]。有研究表明，这些方法均或多或少地存在提取率低、耗时长、杂质多、能耗高、操作复杂及安全性低等缺陷，这些都造成资源的浪费和环境污染，与加热回流法、水煎法、酶解法、超临界流体萃取法相比，微波辅助萃取法溶剂用量较少，萃取时间较短，微波穿透力强，选择性高，辐射均匀，加热效率高[20-23]。微波辐射可以加快物质的反应速度，具有节省时间、工作效力高、节约资源、操作简单且能有效保护天然植物的活性成分等特点，以乙醇作为溶剂，能降低提取的成本和减少对环境的污染。探索成本低、效率高、质量好的葛根黄酮提取工艺，对葛根资源深入开发利用提供有价值的参考，对我国中草药和天然植物资源的综合开发具有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根（市售）；葛根素标准品（纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）；无水乙醇（广东林氏化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

MD8H（pluss）微波合成仪（奥普乐科学仪器成都有限公司）；UV-8000ST紫外-可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司）；BGG-9140A鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；H1650R离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）；FA2204N电子天平（上海箐海仪器有限公司）；JSP-500A粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 葛根黄酮的测定方法

1.3.1.1 葛根素标准曲线的绘制

参考杨丽维等[24]的方法进行测定，以葛根素为标准品，根据测定的吸光度绘制标准曲线，并计算葛根黄酮的含量。

1.3.1.2 提取液黄酮得率的测定

各吸取0.2 mL干葛根和鲜葛根提取液，参考杨青青[25]的方法计算葛根黄酮得率。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 不同料液比对葛根黄酮得率的影响

分别称取3.0 g干葛根和鲜葛根，各5份，置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）分别加入体积分数30%的乙醇溶液搅拌均匀，浸泡5 min；在微波功率255 W、温度60 ℃条件下提取2 min；提取结束后将提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液，定容测定；计算总黄酮得率，选择最佳的料液比。

1.3.2.2 不同微波功率对葛根黄酮得率的影响

分别称取3.0 g干葛根和鲜葛根，各5份，置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），加入30%的乙醇溶液搅拌均匀，浸泡5 min；在不同微波功率（85，170，255，340和425 W）、温度60 ℃条件下提取2 min；提取结束后将提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液，定容测定；计算总黄酮得率，选择最佳的微波功率。

1.3.2.3 不同微波处理时间对葛根黄酮得率的影响

分别称取3.0 g干葛根和鲜葛根，各5份，置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），加入30%的乙醇溶液搅拌均匀，浸泡5 min；在微波功率255 W、温度60 ℃条件下分别提取1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min；提取结束后将提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液，定容测定；计算总黄酮得率，选择最佳的微波处理时间。

1.3.2.4 不同乙醇体积分数对葛根黄酮得率的影响

分别称取3.0 g干葛根和鲜葛根，各5份，置于250 mL锥形瓶中，按料液比1∶20（g/mL），分别加入20%，30%，40%，50%和60%的乙醇溶液搅拌均匀，浸泡5 min；在微波功率255 W、温度60 ℃的条件下提取2 min；提取结束后将提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液，定容测定；并计算总黄酮得率，选择最佳的乙醇体积分数。

1.3.3 正交试验

结合单因素试验及统计分析结果，以葛根总黄酮得率为考察指标，选择恰当的因素和水平设计并开展正交试验，优化（干、鲜）葛根的提取工艺条件。

1.3.4 数据处理

试验数据采用SPSS分析软件和Excel软件进行数据分析及处理。

2 结果与分析

2.1 葛根黄酮的测定方法

根据1.3.1小节中的方法，配制不同质量浓度的葛根素并测定吸光度，绘制葛根素标准曲线，如图1所示。经过统计处理，回归方程为y=68.179x+0.005 2，式中：y为吸光度，x为葛根素质量浓度（mg/mL），相关系数R2=0.999。

图1 葛根素标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 不同料液比对葛根黄酮得率的影响

不同料液比对葛根黄酮得率的影响结果见图2。结果表明：干葛根料液比1∶10（g/mL）时总黄酮得率最低，随着液体占比的增加，总黄酮得率也逐渐增加；料液比1∶20（g/mL）之后总黄酮得率增加的速度开始放缓；料液比1∶25（g/mL）之后总黄酮得率开始下降。由此可知，干葛根适宜的料液比为1∶25（g/mL），此时总黄酮得率为（19.92±0.09）mg/g。鲜葛根料液比1∶10（g/mL）时总黄酮得率最低，料液比1∶15（g/mL）之后，葛根中总黄酮的溶出速度加快；料液比1∶20（g/mL）之后总黄酮得率则开始缓慢下降。由此可知，鲜葛根适宜的料液比为1∶20（g/mL），此时总黄酮得率为（5.88±0.06）mg/g。

图2 不同料液比对葛根黄酮得率的影响

2.2.2 不同微波功率对葛根黄酮得率的影响

不同微波功率对葛根黄酮得率的影响结果见图3。微波功率小于255 W时，随着微波功率的上升，鲜、干葛根总黄酮得率均逐渐增加；微波功率大于255 W时总黄酮得率随着微波功率的增大而下降；微波功率255 W时，鲜、干葛根总黄酮得率达到最大，此时干葛根总黄酮得率为（20.14±0.24）mg/g，鲜葛根总黄酮得率为（5.74±0.13）mg/g。因此，葛根适宜的微波功率为255 W。

图3 不同微波功率对葛根黄酮得率的影响

2.2.3 不同微波处理时间对葛根黄酮得率的影响

不同微波处理时间对葛根黄酮得率的影响结果见图4。微波处理时间1～2.5 min时，随着处理时间的延长，鲜、干葛根的总黄酮得率均不断增加；微波处理时间超过2.5 min时，随着处理时间的延长，总黄酮得率逐渐下降；微波处理时间2.5 min时，葛根总黄酮得率达到最大，此时干葛根总黄酮得率为（20.45± 0.07） mg/g，鲜葛根总黄酮得率为（5.69±0.08）mg/g。因此，葛根适宜的微波处理时间约2.5 min。

图4 不同微波处理时间对葛根黄酮得率的影响

2.2.4 不同乙醇体积分数对葛根黄酮得率的影响

不同乙醇体积分数对葛根黄酮得率的影响结果见图5。在微波提取过程中，乙醇体积分数小于30%时，干葛根总黄酮得率随着乙醇体积分数的增加呈上升趋势；乙醇体积分数30%时提取效果最好，总黄酮得率为（20.85±0.10）mg/g；乙醇体积分数30%～40%时，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率快速下降；乙醇体积分数超过40%时，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮得率缓慢下降。鲜葛根总黄酮得率则随着乙醇体积分数的增加整体呈先缓慢上升后缓慢下降的趋势，也是乙醇体积分数30%时总黄酮得率最高，为（5.95±0.09）mg/g。因此，葛根适宜的乙醇体积分数为30%。

图5 不同乙醇体积分数对葛根黄酮得率的影响

2.2.5 单因素方差分析

对单因素试验结果进行方差分析，以确定各因素对葛根黄酮得率影响的显著性，分析结果见表1。4个因素均对干葛根和鲜葛根总黄酮得率有极显著影响（**，P＜0.01）。

表1 单因素方差分析

2.3 正交试验

根据单因素结果及统计分析，确定具体因素水平，见表2和表3。采用L9(34)正交表，进一步进行正交试验，研究各因素对葛根黄酮得率影响，正交试验设计和结果如表4所示。

表2 干葛根正交试验因素及水平

表3 鲜葛根正交试验因素及水平

表4 正交试验设计与结果

由正交试验结果可知：各因素对干葛根总黄酮得率影响的大小顺序为A＞D＞B＞C，即料液比＞乙醇体积分数＞微波功率＞微波处理时间，最佳工艺为A2B2C1D2，即料液比1∶25（g/mL）、微波功率255 W、微波处理时间2 min、乙醇体积分数30%，此条件下，干葛根总黄酮得率为（21.7±0.2）mg/g；各因素对鲜葛根总黄酮得率影响的大小顺序为B＞D＞A＞C，即微波功率＞乙醇体积分数＞料液比＞微波处理时间，最佳工艺为A2B2C2D2，即料液比1∶20（g/mL）、微波功率255 W、微波处理时间2.5 min、乙醇体积分数30%，鲜葛根总黄酮得率为（6.37±0.05）mg/g。

3 结论

以干葛根和鲜葛根为原料，以乙醇为溶剂，总黄酮得率为评定指标，采用微波辅助萃取法提取葛根中的总黄酮，通过对单因素试验结果进行方差分析，结果表明料液比、微波处理时间、微波功率、乙醇体积分数4个因素对干葛根和鲜葛根总黄酮得率均有极显著影响（P＜0.01）。由正交试验结果可得：各因素对干葛根总黄酮得率影响的大小顺序为料液比＞乙醇体积分数＞微波功率＞微波处理时间，其最佳提取工艺为料液比1∶25（g/mL）、乙醇体积分数30%、微波功率255 W、微波处理时间2 min。在此条件下干葛根总黄酮得率为（21.7±0.2）mg/g。各因素对鲜葛根总黄酮得率影响的大小顺序为微波功率＞乙醇体积分数＞料液比＞微波处理时间，其最佳提取工艺为微波功率255 W、乙醇体积分数30%、料液比1∶20（g/mL）、微波处理时间2.5 min。在此条件下鲜葛根总黄酮得率为（6.37±0.05）mg/g。试验方法可为葛根及其他天然植物资源的黄酮提取和综合开发提供一定借鉴。