SIRT-1、Beclin-1、LC3在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义

王 艳，况 蕾，王 晴，武宸宇，张 蓓

宫颈癌是我国妇女常见的女性生殖道恶性肿瘤，具有发病率高、发现不及时、治疗手段有限和预后差等特点。目前宫颈癌的具体发病机制尚不明确，多数患者与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关。越来越多的研究表明，自噬功能异常亦参与宫颈癌的发病[1]。自噬是一种常见的程序性死亡，是自噬溶酶体降解大部分胞质内容物的一种分解代谢过程。Beclin-1和LC3能够分别参与自噬形成的最初阶段和自噬泡的延长、闭合，是自噬活性的经典指标[2]。有研究发现，HPV-16 E6/E7能通过加速宫颈癌细胞起始阶段的自噬通量来维持适当激活的自噬，即在癌变早期阶段，HPV会反馈性上调细胞自噬活性，具有抑制细胞癌变的作用，而随着肿瘤体积增大或病情进展，癌细胞增殖失控，血液供应不足，则可能通过启动自噬适应环境，从而促进宫颈癌的发展[3]。沉默信息调节因子家族-1(SIRT-1)可通过启动肿瘤细胞自噬，促进癌症的发生和发展[4]。目前有关SIRT1、Beclin-1、LC3在宫颈鳞癌组织中的表达及临床意义研究尚少，因而本研究拟探讨上述指标在正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)1级、CIN 2～3级以及浸润性宫颈鳞癌标本中的表达情况并明确其与宫颈鳞癌患者临床病理及预后的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2014年8月—2015年8月徐州市中心医院妇科行手术治疗后经病理科存档的标本患者为研究对象，包括正常宫颈组织、CIN 1级、CIN 2～3级及宫颈鳞癌组织各50例。其中正常宫颈组织取自因子宫肌瘤或其他非宫颈疾病行子宫全切术的住院患者。纳入标准：组织病理学诊断明确；有剩余组织可供行免疫组化染色。排除标准：宫颈鳞癌患者术前接受放疗、化疗等治疗；术后失访；临床或病理资料无法分析者。

1.2方法

1.2.1临床资料收集：通过电子病历系统收集宫颈癌患者的临床和病理资料，包括年龄、国际妇产科联盟(FIGO)分期、肿瘤分化程度(高分化、中低分化)、HPV-16/18感染状态以及有无淋巴结转移等。对所有患者行电话随访，随访终点为全因死亡，随访时间为从确诊至出现终点事件或末次随访(2022年1月)的时间间隔。若患者失访，则记录末次随访时间和状态为删失数据。

1.2.2免疫组化检测方法：将所有组织标本石蜡包埋、每个蜡块4 μm厚连续切片，常规梯度乙醇脱水后行高温下抗原修复。滴加3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性。加入兔抗人Beclin-1(Proteintech公司，11306-1-AP)、LC3 A/B(Affinity公司，AF5402)和SIRT-1(Affinity公司，df6033)，4 ℃过夜，滴加山羊抗兔IgG抗体-辣根过氧化物酶多聚体工作液，DAB显色，封片和拍照。由2名经验丰富的病理科医师对切片独立进行评估。采用半定量评分标准，对细胞染色比例及强度分别进行评估[5]。阳性细胞率≤5%、5%～25%、25%～50%、50%～75%和>75%分别记为0、1、2、3和4分。染色强度无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别记为0、1、2和3分。每张切片中至少选取10个高倍(400×)视野进行阳性细胞比例分析，每个视野中应至少计数100个细胞，根据其阳性细胞百分比进行评分。若染色强度得分×阳性细胞率得分<4分则判定为阴性，而≥4分则判定为阳性。

1.3观察指标 观察各组Beclin-1、LC3和SIRT-1免疫组化染色情况及与宫颈鳞癌临床病理特征关系，分析上述指标之间的相关性及影响预后的相关因素。

1.4统计学方法 应用SPSS 22.0软件分析数据。计数资料以率(%)表示，采用χ2检验。相关性采用Spearman相关性分析。宫颈鳞癌患者预后的影响因素应用单因素和多因素Cox回归分析。α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1SIRT-1、Beclin-1及LC3在各类宫颈组织中的表达情况 在正常宫颈组织，SIRT-1多为阴性，而Beclin-1和LC3多为阳性。随着CIN的发生及进展，SIRT-1阳性率逐渐增高，而Beclin-1和LC3的阳性率逐渐降低，SIRT-1、Beclin-1和LC3组间整体比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。正常宫颈组织、CIN 1级组织、CIN 2～3级组织和宫颈鳞癌组织SIRT-1、Beclin-1和LC3阳性表达情况见图1。

表1 SIRT-1、Beclin-1及LC3在不同宫颈组织中的表达情况[例(%)]

2.2SIRT-1、Beclin-1和LC3表达与宫颈鳞癌临床特征的关系 SIRT-1阳性率在年龄≥50组、FIGO Ⅲ～Ⅳ期组、中低分化组及淋巴结转移组显著升高，Beclin-1和LC3阳性率在FIGO Ⅰ～Ⅱ期组和无淋巴结转移组显著升高(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 SIRT-1、Beclin-1和LC3表达与宫颈鳞癌临床特征的关系(例)

2.3宫颈鳞癌组织中SIRT-1与Beclin-1、LC3表达的相关性 宫颈鳞癌组织中SIRT-1与Beclin-1和LC3呈显著负相关(r=-0.62、-0.57，P<0.001)。

2.4影响宫颈鳞癌患者预后的单因素和多因素分析 纳入的50例末次随访时共33例(66.0%)死亡，中位随访时间30(23～42)个月。单因素分析表明，年龄≥50岁、FIGO Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、SIRT-1阳性及Beclin-1阴性是宫颈鳞癌预后不良的危险因素(P<0.05，P<0.01)。见表3。Cox多因素分析表明，年龄≥50岁、FIGO Ⅲ～Ⅳ期和SIRT-1阳性是宫颈鳞癌患者预后不良的独立危险因素(P<0.05，P<0.01)。见表4。

表3 影响宫颈鳞癌患者预后的单因素分析(例)

表4 宫颈鳞癌患者预后不良的危险因素Cox回归分析

3 讨论

SIRT-1本质上属于脱乙酰酶，从组蛋白和非组蛋白中去除乙酰基是其主要生物学功能。此外，研究还表明，SIRT-1能够通过调控众多细胞内因子广泛参与细胞的增殖、凋亡、衰老及新生血管生成等[6-7]。本研究结果显示，SIRT-1在正常宫颈组织中表达较少，在CIN及宫颈鳞癌组织中表达明显增加，表明SIRT-1上调可能参与了宫颈鳞癌的发生。张惠文等[8]证实，SIRT-1在正常宫颈、低级别CIN、高级别CIN及宫颈癌组织中的阳性率分别为0、15.38%、37.14%和40.00%，本研究结果与其报道相似。SINGH等[9]研究亦发现随着宫颈病变程度的加重，SIRT-1的表达水平亦逐步上调。

SIRT-1与宫颈鳞癌组织分化程度低、FIGO分期高、淋巴结转移及预后不良有关，提示其可能参与了宫颈鳞癌的组织分化、转移等重要的病理生理学过程。WANG等[10]研究表明，SIRT-1表达与HPV-16 E7蛋白呈显著正相关，敲除SIRT-1后宫颈癌细胞的增殖、迁移和浸润能力显著降低。另有研究表明，敲除SIRT-1后能够诱导宫颈癌细胞凋亡，而其本身能够抑制宫颈癌细胞对HPV的抵抗力[11]。

Beclin-1是自噬调控基因，能够与Ⅲ型磷酸肌醇-3-激酶结合，形成能够与多种蛋白质相互调节的核心复合体参与细胞自噬的调控。LC3分为LC-3A和LC-3B两种亚型，前者于细胞质中常规表达，后者在细胞发生自噬时表达于自噬体膜上。有学者通过Western Blot方法证实Beclin-1和LC-3蛋白含量随着宫颈CIN病变严重程度的增加而逐渐下降[12]，本研究结果与其一致。本研究发现，Beclin-1、LC-3与宫颈癌FIGO分期和淋巴结转移有关，与CHENG等[13]报道结果一致。然而，ZHU等[14]报道Beclin-1、LC-3与FIGO Ⅰ～Ⅱ期宫颈鳞癌分化程度、淋巴结转移等病理学特征无明显相关性。本研究单因素分析发现，Beclin-1与宫颈癌患者预后不良有关，但是其在多因素分析中并无统计学意义，分析原因可能为本研究样本量较少等因素导致。既往有大量文献报道，Beclin-1和LC3等自噬相关蛋白表达水平与多种恶性肿瘤预后相关[15-17]，孟志英等[18]发现，Beclin-1阳性的宫颈癌患者生存期长于Beclin-1阴性者。因此未来有必要增加样本量对Beclin-1与宫颈癌患者预后的关系作进一步探讨。

综上所述，随着宫颈病变严重程度的进展，SIRT-1表达量明显增加，而自噬相关蛋白Beclin-1和LC3表达显著下降，三者与FIGO分期、淋巴结转移等有关，且SIRT-1高表达与宫颈鳞癌预后不良有关。提示SIRT-1、Beclin-1和LC3在宫颈鳞癌的发生、进展、转移中扮演重要的角色，可能作为评估宫颈鳞癌预后的生物学标志物。