养肺保元汤调节Samd表达改善大鼠慢性阻塞性肺疾病合并肺间质纤维化

吴俣 刘良丽 朱晓龙

(贵州中医药大学第一附属医院呼吸内科，贵州 贵阳 550000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续气流受限为特征的疾病，世界卫生组织预测2030年，COPD将成为全球第三位的致死原因，COPD给全世界所带来的经济负担将列为所有单病种排位的第五位〔1，2〕。肺间质纤维化(PIF)是以肺泡壁为主，包括肺泡周围组织及其相邻支气管结构发生病变的一组疾病群，临床表现为进行性呼吸困难或刺激性干咳〔3，4〕。研究发现肺间质和肺泡纤维化是COPD病变向肺组织深处发展的结果，PIF是COPD发展的必然趋势和病理结局〔5〕。COPD合并PIF后，患者会出现更加严重的缺氧和肺部高压症状，预期的生存年限中位数也会降低至6年〔6，7〕。因此抑制COPD向合并纤维化发展有重要意义。转化生长因子(TGF)-β1/Smad通路是调节组织稳态的关键通路，TGF-β1/Smad通路上调会促进成纤维细胞分化和迁移，在肾脏、肝脏和PIF的研究中都发现了TGF-β1/Smad通路异常激活的情况〔8～10〕。本研究以COPD合并PIF大鼠模型为研究对象，检测养肺保元汤(YFBY)对PIF的抑制作用，探讨YFBY对TGF-β1/Smad通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1实验材料 SD大鼠，雄性，重250～300 g，15只〔SCXK(湘)2016-0002，湖南斯莱克景达实验动物有限公司〕、香烟、YFBY(黄芪30 g、党参 15 g、生地黄15 g、熟地黄15 g、太子参15 g、麦冬15 g、当归15 g、淮山药15 g、川芎10 g、茯苓15 g、炒白术15 g、甘草3 g等，由贵阳中医学院第一附属医院药剂科提供，用上述组方500 g加水1 000 ml煎煮 2遍，合并煎液为100 ml)。

1.2主要试剂 苏木素染液、伊红染色液(BOSTER)；TUNEL检测试剂盒(碧云天)；大鼠TGF-β1试剂盒〔酶联免疫吸附试验(ELISA)〕；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH、辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金桥)；Rabbit Anti-Smad2、Rabbit Anti-Smad3、Rabbit Anti-Smad7(Abcam)。

1.3COPD合并 PIF造模 12只大鼠于自制60 cm×50 cm×40 cm的有机玻璃吸烟箱吸烟，吸烟量为5支/次，每天1次，每次吸烟时间为1 h，共计42 d。

1.4实验分组和给药 15只SD雄性大鼠，适应性饲养1 w后，随机分成正常对照组(Normal组)3只、COPD合并PIF模型对照组(Model组)4只、COPD合并PIF+YFBY(YFBY组)4只。除Normal组外进行COPD合并PIF造模，造模结束后开始给药，为期1个月。YFBY组每天灌胃养肺保元汤，3次/d，每次3 ml；而Model组每天灌胃生理盐水，3次/d，每次3 ml。

1.5苏木素-伊红(HE)染色 样本用甲醛固定完毕后，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，水洗，返蓝液返蓝15 s，流水冲洗，伊红染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，中性树脂封片，镜检。

1.6TUNEL染色 将石蜡切片进行烤片，然后脱蜡，水化。将切片移入湿盒中，每个样本上滴加 50 μg/ml Proteinase K工作液，37℃反应30 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。每个样本上滴加足够量的TUNEL检测液，45℃避光孵育2 h。PBS洗涤3次。封片，镜检。

1.7ELISA检测 血浆样品直接进行检测。根据大鼠TGF-β1试剂盒说明书进行加样、加酶、温育、配液、洗涤、显色、终止、测定等操作。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品实际浓度。

1.8Western印迹检测 取组织液氮研磨成粉末，加入裂解液后再次研磨，将组织匀浆吸入一EP管中，冰上裂解30 min后，4℃，10 000 r/min离心10 min，小心吸取上清，即可获得总蛋白。根据二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定蛋白浓度，蛋白变性，上样，进行十二烷基硫酸钠凝胶电泳1～2 h后湿法转膜2 h。一抗溶液孵育，4℃过夜；二抗溶液中室温孵育1～2 h。在膜上滴加电化学发光(ECL)曝光液，在凝胶成像系统中曝光。用Quantity one软件分析各抗体条带灰度值。

1.9统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1YFBY对TGF-β1/Smad 通路的影响 与Normal组比较，Model组Smad2、Smad3、Smad7水平显著升高(P<0.05)；与Model组比较，YFBY组Smad2、Smad3水平显著降低(P<0.05)。见图1、表1。Normal组、Model组、YFBY组TGF-β1水平〔(16.80±1.286,17.01±0.864,16.62±1.640)ng/ml〕无显著差异(P>0.05)。

图1 各组肺组织中Smad2、Smad3和Smad7蛋白表达

表1 肺组织中Smad2、Smad3和Smad7与内参 GAPDH相比的蛋白相对表达量

2.2YFBY对大鼠COPD合并PIF的治疗效果 相比于Normal组〔(11.00±1.00)个〕，Model组肺泡变小，肺泡间质增厚有炎性细胞浸润，组织中有更多细胞凋亡。YFBY组肺泡间质增生程度〔每个视野的TUNEL阳性细胞数(19.67±3.51)个〕显著低于Model组〔(51.33±14.01)个，P<0.05〕，细胞凋亡也低于Model组。见图2。

蓝色为细胞核，绿色为凋亡细胞图2 各组肺部组织

3 讨 论

吸烟是COPD的首要诱因〔11〕。TGF-β1/Smad通路上调会促进细胞增殖抑制细胞凋亡，尤其对成纤维细胞上皮间质转化(EMT)有显著诱导作用，最终导致相应区域的组织纤维化，特发性PIF就是一种典型病症〔9，12〕。TGF-β1/Smad 通路中TGF-β1是激活通路的细胞因子，而Smad则是一类受TGF-β受体激活的信号蛋白〔13〕。Smad2和Smad3被激活后会从TGF-β受体转移至细胞核，引发促纤维化基因过表达〔14〕。Smad7的表达同样受Smad2和Smad3诱导，但是Smad7主要起着抑制TGF-β受体活性的功能，从而达到抑制TGF-β1/Smad通路的效果〔15〕。本研究结果说明COPD合并PIF造模会上调肺组织中TGF-β1/Smad通路，而HE染色结果中PIF水平和TGF-β1/Smad通路激活水平相应，可以推测YFBY抑制PIF的疗效与TGF-β1/Smad通路激活水平相关。