一过性食管下括约肌松弛动物模型的建立及其机制探讨

朱海燕 张咩庆

[摘要] 目的 建立一过性食管下括约肌松弛（TLESR）的大鼠模型并探讨其发生机制。 方法 SD雄性大鼠随机分为4组：空白对照组、模型组、药物（saclofen）注射组、空白注射组，每组12只。通过逐次向胃内注水的方法建立胃扩张诱发TLESR的动物模型。药物注射组和空白注射组在进行胃扩张30 min前，用微量注射法往孤束核区注射GABAB受体阻断剂saclofen或改良Riger液。采用消化道动力检测系统检测、分析TLESR频率，采用免疫组织化学法观察孤束核区GABAB受体表达。 结果 模型组大鼠TLESR频率提高，GABAB受体表达减少，向孤束核区微量注射GABAB受体阻断剂可大幅提高TLESR频率。 结论 提示胃扩张造模成功，TLESR的发生与孤束核中GABAB受体调节密切相关。

[关键词] 一过性下食管括约肌松弛;造模;胃扩张;GABAB受体

[中图分类号] R571          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）04-0035-04

[Abstract] Objective To establish a rat model of transient lower esophageal sphincter relaxation（TLESR） and explore its mechanism. Methods SD male rats were randomly divided into 4 groups： Blank control group， model group， drug（saclofen）injection group and blank injection group， with 12 rats in each group. An animal model of gastric expansion induced TLESR was established by successively injecting water into the stomach. The drug injection group and the blank injection group were injected with the GABAB receptor blocker saclofen or modified Riger solution into the solitary nucleus region by microinjection before the gastric dilation was performed for 30 min. The frequency of TLESR was detected and analyzed by digestive tract dynamic detection system， and the expression of GABAB receptor in the solitary nucleus was observed by immunohistochemistry. Results In the model group， the frequency of TLESR increased and the expression of GABAB receptor decreased. Microinjection of GABAB receptor blocker into the solitary tract nucleus region could significantly increase the frequency of TLESR. Conclusion It is suggested that the gastric dilatation model is successful， and the occurrence of TLESR is closely related to the regulation of GABAB receptor in the solitary tract nucleus.

[Key words] Transient lower esophageal sphincter relaxation; Modeling; Gastric dilatation; GABAB receptor

胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是临床常见疾病，我国近年来本病患病率在逐年升高[1]。一过性食管下括约肌松弛（transient lower esophageal sphincter relaxation，TLESR）被认为是其发病根本病因[2]。TLESR是指与吞咽无关的食管下括约肌自发性松弛[3]，伴随食管下括约肌压力（low esophageal sphincter pressure，LESP）突然降低，其松弛时间可持续10～45 s，明显长于吞咽时食管下括约肌松弛时间（6～8 s），且降低≥5 mmHg。查慧等[4]研究发现健康人中有35%的TLESR伴随胃食管反流，而GERD患者中有65%的TLESR伴随胃食管反流，发生率明显高于健康人。所以對于GERD的研究，不管在临床还是在基础研究中，如何抑制TLESR逐渐成为很多学者的关注点。既往有研究表明TLESR在进食、胃扩张时易发生，其发生机制可能与迷走神经兴奋有关，有研究显示将犬颈部迷走神经冷冻可完全阻断TLESR[3]。脑干孤束核作为迷走神经中枢接受胃扩张等引发的神经冲动，作用于食管下括约肌，在引发TLESR的过程中可能起重要作用[4]。γ-氨基丁酸（γ-aminobutiric acid，GABA）作为广泛存在于中枢神经系统中的抑制性神经递质，孤束核中也存在大量GABA能神经元及GABAB 受体。对孤束核内GABA能神经末梢的超微结构研究显示GABAB受体和外周传入末梢有紧密的联系[5]。虽然研究表明，调节孤束核中GABAB受体可影响迷走神经机械感受器，改变迷走神经传出冲动[6]，但其在引发TLESR中作用尚不明确，本研究旨在探讨脑干孤束核中GABAB受体在胃扩张模型大鼠发生TLESR中的作用。

1 材料与方法

1.1 實验动物

SPF级健康雄性SD大鼠48只，体重350～400 g，平均2.5月龄，均由上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK（沪）2013-0016]提供，随机分为4组：空白对照组、模型组、药物注射（saclofen）组、空白注射组，每组12只。该实验在浙江中医药大学动物实验研究中心完成[SYXK（浙）2013-0184]。

1.2 实验方法

1.2.1 胃扩张诱发TLESR模型  大鼠予10%水合氯醛（0.35 mL/100 g 体重）腹腔注射麻醉（禁食10 h）后，予轻柔地插一端套有薄膜囊的聚乙烯软管入胃，深度为下食管括约肌下4 cm，向气囊内注水，给予胃内压≥5.32 kPa（40 mm Hg）压力的时相性胃扩张（注水2 min，间歇4 min，交替进行，6 min为1轮，共10轮）[7，8]。

1.2.2 孤束核内微量注射针的埋入  大鼠腹腔注射麻醉后，固定于立体定向仪上，切开大鼠头部皮肤，暴露骨缝，参照 LJ.Pellegrine 鼠脑定向图谱，颅骨钻孔，埋植不锈钢套管（外径0.5 mm，内置直经0.3 mm的不锈钢丝，其下端比套管长0.5 mm），微量注射时，将不锈钢丝内芯拔出，微量注射针超出外套管1 mm，用于局部微量注射。

1.2.3 实验流程  将适度麻醉的大鼠仰卧固定于实验台上，采用消化道动力检测系统（型号：GAP-08A），经口插入测压管，使远端3个通道均置于胃内，开始记录测压数据。采用定点牵拉法（每15秒向外牵拉测压管10 mm）匀速牵拉测压管直至第2（或含第3）通道显示位于LES内时，将测压管固定于动物口边。此时，第1通道位于胃内，第2（或含第3）通道位于LES，检测并分析TLESR的发生频率。空白对照组：不给予任何处理。胃扩张模型组在进行胃扩张的同时开始测压。药物（saclofen）注射组和空白注射组在进行胃扩张30 min前，微量注射针连接微量注射泵，以1 μL/min 的速度向孤束核区注射1 μL的Saclofen（美国Sigma公司）或改良Riger液，注入时程为1 min，30 min后进行胃扩张的同时开始测压。

1.2.4 样本制作  用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉后开胸，向左心室灌注生理盐水冲洗至右心房流出的液体变清，再用4%多聚甲醛溶液快速灌注固定，之后继续缓慢固定30 min，断头取延髓界沟的外侧（孤束核），标本浸泡于4%多聚甲醛溶液6 h，然后于4℃时用15%蔗糖溶液脱水24 h，再于4℃用30%蔗糖溶液脱水48 h，标本全部沉至容器底部，取出标本，用锡箔纸包裹密封，液氮迅速冷冻。于恒温冷冻切片机内连续冠状位冰冻片，片厚20 μm。

1.3检测指标

TLESR发生检测系统：消化道动力检测系统（型号：GAP-08A）检测。TLESR的判定标准：LES从开始松弛到完全松弛的时间≤10 s;LES的最低压力应≤2 mmHg。此外，对于压力≤2 mmHg，松弛时间≥10 s的LES 松弛，且可以除外是由于多次快速吞咽所致可以被认为是TLESR。免疫组化法检测孤束核区GABAB受体的表达：将上述制作好的样本在电镜下观察免疫组织化学染色切片。选择3个200倍视野，通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位，计算阳性细胞的总面积。

1.4 统计学方法

实验数据资料用SPSS19软件进行统计分析，TLESR频率、GABAB受体阳性面积测定值用（x±s）表示，进行单因素方差分析，组间数据比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠TLESR频率结果

2.2 各组大鼠孤束核区GABAB受体免疫组化染色结果

与空白对照组相比，模型组GABAB受体阳性面积明显减少，差异有统计学意义（t=12.53，P<0.01）;与空白注射组相比，药物注射组GABAB受体阳性面积较高，差异有统计学意义（t=2.48，P=0.03），见表2、封三图7。

3 讨论

TLESR是近年来发现的胃食管反流病发病的主要机制之一，主要有以下特征：（1）与吞咽无关的LESP突然降低或接近胃内压的水平（≥5 mmHg）;（2）LES松弛前4 s和后2 s无咽部吞咽信号;（3）其发生时间持续长于吞咽诱发的LES松弛时限，持续约10～45 s，吞咽诱发的LES松弛时限多为6～8 s;（4）缺乏食管体部的蠕动收缩。有研究表明，胃底膨胀、胃排空迟缓会增加TLESR的频率，是胃食管反流发生因素之一[9]。根据这一系列理论，结合既往相关实验经验[10]，本研究组利用大鼠胃内注气进行胃扩张来诱发TLESR，同时采用低顺应性毛细管灌注测压系统记录、分析TLESR发生频率。试验期间模型组大鼠的TLESR发生频率明显高于空白对照组，表明胃扩张诱发TLESR模型大鼠造模成功。

既往研究表明，γ-氨基丁酸B受体（γ-aminobutyric acid B receptor，GABAB-R）在调控TLESR相关迷走神经信号传导的过程中发挥着重要的作用。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中枢及外周神经系统中重要的抑制性神经递质，通过介导下游的GABAA和GABAC受体以及代谢型GABAB-R发挥生理功效。其中GABAB-R大量存在于迷走神经中枢孤束核中，参与中枢神经系统中多种神经活动并发挥重要功能[11]。孤束核是脑干内接受内脏初级感觉传入信息的重要核团，接受由迷走神经传入的胃扩张等引发的感觉信号，调控食管下括约肌，在引发TLESR的过程中起重要作用[12]。对孤束核内GABA能神经末梢的超微结构研究显示GABAB受体和外周传入末梢有紧密的联系[13]，调节孤束核中GABAB受体可影响迷走神经机械感受器，改变迷走神经传出冲动[6]。既往在动物实验中也发现GABAB-R激动剂Baclofen可以影响食管下括约肌压力，减少酸与非酸反流[14]。临床研究也得出类似的结论，在健康志愿者和胃食管反流病患者中均发现Baclofen可以明显减少可明显减少24 h 的胃食管反流并增加食管pH[15，16]。因此本研究组推测孤束核中GABAB-R在孤束核对于食管下括约肌的调节中扮演了重要角色，参与迷走神经-食管中枢调控机制，与TLESR的发生存在一定关系。为了证实该推测，本研究组应用孤束核内微注射GABAB受体拮抗剂saclofen对胃扩张诱发TLESR模型大鼠进行预处理以观察GABAB受体对TLESR发生的控制作用。结果发现，GABAB受体拮抗剂saclofen组较空白注射组的TLESR发生频率大幅上升，说明GABAB受体调节与TLESR的发生密切相关。进一步的免疫组化染色结果显示，模型组大鼠与空白对照组大鼠比较，孤束核中GABAB受体表达下调，两组间差异存在显著性意义，与此同时，模型组大鼠相较于空白对照组大鼠的TLESR发生频率显著增加。说明孤束核中GABAB受体表达下调与TLESR的发生及其合并反流减少存在相关性。但GABAB受体表达在TLESR发生过程中的调控机制仍不清楚，可能与孤束核中GABA神经递质含量变化有关，仍需进一步实验分析。同时我们发现与空白注射组相比，GABAB受体拮抗剂saclofen组的GABAB受体表达上调，这也许是由GABAB受体被拮抗引发的代偿性变化。既往研究表明，通过一定手段干预孤束核可调节消化道运动[17-19]，而本实验结果进一步提示孤束核中GABAB受体在胃扩张诱发TLESR发生及其合并反流的过程中发挥重要作用，但具体的机制有待进一步研究。

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（收稿日期：2018-09-11）