蛋鸡输卵管炎造模方法的筛选与验证

朱永明 王倩 宋玉卓 郗艳菊 郭永红 范开

摘 要：为了筛选蛋鸡输卵管炎造模方法，采用30%苯酚胶浆和大肠杆菌、沙门氏菌混合菌液分别对健康蛋鸡进行造模，通过观察造模后蛋鸡的精神状态、输卵管病理切片、酶联免疫吸附法检测炎症因子IL-2、IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量对造模效果进行评价。结果表明，30%苯酚混合明胶、甘油注入蛋鸡子宫部可造成输卵管炎，表现为不安，喜卧，站立不直，被毛凌乱，产蛋困难，黄白色分泌物增多;其所产的鸡蛋蛋壳表面出现血迹，有大小不等的颗粒;输卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒细胞浸润，并有弥漫的趋势;血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均显著高于对照组（P<0.05）;而大肠杆菌、沙门氏菌混合菌液造模不会导致输卵管炎，与对照组相比无差别。本试验结果显示，30%苯酚胶浆导入输卵管子宫部可以建立良好的输卵管炎模型，优于大肠杆菌和沙门氏菌的混合菌液模型。

关键词：蛋鸡;输卵管炎;造模;验证

中图分类号：S858.31 文献标识码：B文章编号：1673-1085（2021）10-0005-06

收稿日期：2021-08-20

*基金项目：河北省功能性饲料添加剂技术创新中心建设补助经费（217790537H）。

作者简介：朱永明（1992-），女，河北沧州人，硕士，研究方向为微生物学，E-mail：779546000@qq.com;并列第一作者：王倩（1991-），女，河北石家庄人，学士，研究方向为制剂工艺研究，E-mail：406299391@qq.com。

**通讯作者：郗艳菊（1981-），女，河北沧州人，硕士，研究方向为动物营养，E-mail：149697628@qq.com。

输卵管炎是威胁蛋鸡健康的常发病之一，影响蛋鸡生产性能的发挥，多发生于初产蛋鸡、高产蛋鸡[1，2]。当蛋鸡处于产蛋期，输卵管每天都高负荷工作，难免会出现问题;尤其是鸡舍环境不洁净造成大肠杆菌、沙门氏菌等病原菌容易由泄殖腔侵入输卵管引发输卵管炎，会使产蛋率下降5%～30%，主要造成蛋壳品质的下降[3、4]，严重影响养殖户的经济效益。

为了更好地研究蛋鸡输卵管炎，本试验对输卵管炎的造模方法进行筛选，模拟输卵管炎的发病情况，筛选出最佳输卵管炎造模方法，并通过对蛋鸡精神状态、输卵管组织切片以及炎症因子鸡白介素2（IL-2）、鸡白介素6（IL-6）、鸡肿瘤坏死因子（TNF-α）、鸡γ干扰素（IFN-γ）含量进行评价，以对造模后输卵管炎进行验证，为后续治疗蛋鸡输卵管炎药物的临床应用奠定基础。

1 试验材料

1.1 试剂

大肠杆菌、沙门氏菌由实验室分离自临床商品蛋鸡输卵管炎病例;苯酚胶浆由中国农业大学动物医学院实验室自制;伊红-苏木精购自上海山浦化工有限公司;IL-2试剂盒（E-EL-Ch0120c）、IL-6试剂盒（E-EL-Ch0228c）、TNF-α试剂盒（E-EL-Ch0215c）、IFN-γ试剂盒（E-EL-Ch0026c）均购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司。

LB培养基、LA培养基按照微生物学实验教程[5]进行配置。

1.2 试验动物及分组

试验鸡是处于高产期的白莱航蛋鸡，90羽，随机分为3组，分别为空白组30羽、大肠杆菌与沙门氏菌混合菌液组30羽、苯酚胶浆组30羽。

1.3 主要仪器

MB-530酶标分析仪，深圳市汇松科技发展有限公司;MLS-3020高压蒸汽灭菌锅，SANYO;AUW120D电子天平，SHIMADZU;THZ-98AB恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司;JB-CJ-2FD洁净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司;SPX-150B-Z型生化培养箱，上海博远安业有限公司。

2 试验方法

2.1 混合菌液制备

用灭菌过的接种环挑取斜面上的大肠杆菌、沙门氏菌，将菌种接种于LA培养基上，37 ℃培养24 h进行活化，然后分别挑取菌落接种到装瓶量50 mL/300 mL的LB液体培养基中，180 r/min、37 ℃培养18 h，采用10倍法平板计数估算菌液浓度，分别将大肠杆菌和沙门氏菌菌液浓度调至2×109 cfu/mL，然后3：2混合，備用。

2.2 30%苯酚胶浆制备

参考文献[6、7]进行改进，称取30 mL 液化苯酚、5 g明胶、20 mL甘油，加蒸馏水至100 mL，置于锥形瓶中，密封保存，备用。

2.3 建模

建模方法参考姬晓琪的方法[6]：取出试验鸡，至于解剖台上，使其仰卧保定，左手握住两侧跖部，掌心紧贴着蛋鸡的龙骨突，使蛋鸡背部靠紧解剖台，泄殖孔朝上;右手母指和食指分开附于泄殖孔下方的羽毛，轻轻地向下按压，可见泄殖腔泄殖道背侧宽大的输卵管口，另一人将药剂导入距输卵管口2～3 cm处即可。

试验前，每天早晚两次正常饲喂，直至蛋鸡产蛋率稳定在80%以上后开始建模;空白组（A组）不做处理，苯酚胶浆组（B组）注射1 mL的苯酚胶浆，混合菌液组（C组）注射1 mL的混合菌种培养液。

2.4 观察及检测指标

2.4.1 观察蛋鸡精神状态 观察蛋鸡产蛋量以及异常蛋情况。

2.4.2 病理学观察 建模48 h后每组取3只蛋鸡进行放血和剖检，观察气囊和卵巢组织的变化情况，并取卵巢及输卵管组织进行切片制作。

石蜡切片制作及HE染色流程[8]：固定→冲洗→修块→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烘片→复水→染色→脱水→透明→封片。

2.4.3 酶联免疫吸附试验 取全血在37 ℃条件下放置1 h（不加抗凝剂），4 ℃冰箱过夜，当血清自然析出后，以 4℃、3000 r/min离心10 min，分离血清，弃去不溶物，将血清移至一干净离心管，-80 ℃保存备用，参考试剂盒说明书步骤进行血清中的炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平检测。

2.4.4 统计分析 采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，结果采用“平均值±标准差”，以P<0.05为差异显著性判断。

3 结果

3.1 建模后蛋鸡的临床表现

采用30%的苯酚胶浆对白莱航蛋鸡建模后，蛋鸡表现为不安，喜卧，站立不直，被毛凌乱，产蛋困难，黄白色分泌物增多，使泄殖孔周围的羽毛浸入分泌物，泄殖腔有粪便沾染，其所产的鸡蛋蛋壳表面出现血迹，有大小不等的颗粒;而混合菌液组则与空白对照组临床表现一致，二者在蛋鸡外观及鸡蛋表面无明显差别，蛋鸡表现站姿正常，羽毛干净有光泽，泄殖腔无粪便沾染，产蛋顺畅，蛋形正常，表面光洁。剖解后，苯酚胶浆组蛋鸡气囊透明，卵巢正常，卵泡排列有序，输卵管子宫部呈紫红色，炎症反应明显;混合菌液组与空白对照组的内脏器官均无明显病变。三组的蛋鸡外观和鸡蛋表面变化见图1、图2。

3.2 组织病理学结果

空白对照组的输卵管子宫部组织结构完整，层次清晰，细胞组成正常（图3，A）。苯酚胶浆组输卵管被覆上皮增厚，嗜中性粒细胞浸润，并有弥漫的趋势（图3，B）。混合菌液组的输卵管结构与空白对照组相似，未见炎症特征（图3，C）。苯酚胶浆呈现良好的建模效果，优于混合菌液建模。

3.3ELISA检测炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量变化

由表1可知，B组蛋鸡的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均显著高于空白对照组（P<0.05）且具有统计学意义;C组蛋鸡的血清中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量与空白对照组相比无明显差异;B组蛋鸡血清中的IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量均显著高于C组（P<0.05）且具有统计学意义，说明B组即苯酚胶浆组可以引起蛋鸡输卵管炎炎症反应。

4 讨论

目前输卵管炎造模以化学法和病原菌法的方式比较常见。化学造模法以苯酚为主，具有验证反应快、反应明显等优点，缺点是与临床实际病症不一致;病原微生物造模法以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等接种为主，具有与临床实际病症一致的优点，缺点是反应慢、炎症反应不明显。

张小丽等[9]用15%的液化苯酚，混合适量纤维素，制成苯酚糊剂进行大鼠输卵管炎的造模，结果显示用苯酚胶浆注入双侧输卵管内造成大鼠输卵管炎症模型是成功而可行的。苯酚为常用的消毒剂的主要成分之一，使蛋白质变性，对黏膜等具有强烈的腐蚀性，可对输卵管黏膜形成损伤，破坏黏膜的防御功能，从而使定植于泄殖腔的条件性致病微生物侵染而造成输卵管炎。而自然发病的蛋鸡输卵管炎亦是蛋鸡因产蛋频繁，输卵管分泌长期处于旺盛状态，当身体条件特别是温度、湿度、营养等因素发生变化时，部分敏感鸡只出现与上述相似情况，条件致病微生物突破黏膜屏障，造成炎症反应。

欧阳紫婷等[10]以大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌按2∶1∶1比例配制成浓度约为3×109 cfu/mL的混合菌，从外阴道插入直达子宫底部注射，对70只大鼠进行输卵管炎的造模，结果显示有50只大鼠造模成功。而禽类与哺乳动物不同，其消化系统、生殖系统和排泄系统在泄殖腔泄殖道汇合，产卵频繁造成输卵管口无法完全闭合，几乎完全开放于泄殖腔，泄殖腔中常在微生物群落复杂、丰富，可以随时进入输卵管中，其中大肠杆菌数量较多，因此，在黏膜屏障状态良好时导入混合菌液无法造成相应的效果，因此单纯导入混合菌液无法建立炎症模型。

炎症在病原体入侵或组织损伤后被激活，在生理上起著保护宿主正常功能的作用，炎性细胞因子是指参与炎症反应的各种细胞因子，主要的炎性细胞因子包括IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ[11，12]。TNF-α和IFN-γ是在机体免疫网络中起调节作用的重要因子，IL-2和IL-6含量可反映机体免疫功能的强弱[13]。姬晓琪[6]用25%的苯酚胶浆注射进入蛋鸡子宫部，观察发现蛋鸡坐立不安，疼痛，产出带血迹的蛋，通过检测炎性因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量发现显著高于未造模组，输卵管病理切片发现有中性细胞浸润，说明用苯酚胶浆可以成功建立蛋鸡输卵管模型。

5 结论

30%苯酚混合明胶、甘油导入输卵管子宫部可以建立良好的输卵管炎模型，优于大肠杆菌和沙门氏菌的混合菌液模型。30%苯酚胶浆法造模可引起蛋鸡输卵管的炎症反应，是一种可靠的蛋鸡输卵管炎造模方法。

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Screening and Verification of Modeling Methods for Layer Salpingitis

ZHU Yongming1，3，4，WANG Qian1，3，SONG Yuzhuo1，4，XI Yanju1，3，4*，GUO Yonghong1，3，4，FAN Kai5

（1.Hebei Weierli Animal Pharmaceutical Group Company Ltd， Shijiazhuang Hebei   050227， China;

2.College of Life Sciences， Hebei Agricultural University， Baoding Hebei   071001， China; 3.Hebei Province Functional Feed Additive Technology Innovation Center，Shijiazhuang Hebei 050227， China;

4.Shijiazhuang Animal Functional Additive Engineering Technology Research Center， Shijiazhuang Hebei   050200， China;

5.China Agricultural University，Beijing   100193， China）

Abstract： In order to screen the methods of modeling salpingitis in laying hens， 30% phenol glue and mixed bacterial liquid of Escherichia coli and Salmonella were used to model healthy laying hens. The effect of modeling was evaluated by observing the mental state of laying hens， pathological sections of fallopian tubes， and detecting the content of inflammatory factors IL-2， IL-6， TNF-α， IFN-γ by enzyme-linked immunosorbent assay.The results showed that injection of 30% phenol mixed gelatin and glycerin into the uterus of laying hens could cause salpingitis， which manifested as restlessness， lying down， not standing straight， messy coat， difficulty in laying eggs， and increased yellow and white secretions;There were blood stains on the surface of the eggshell， which fulled of particles of varying sizes; the fallopian tube were thickened by the epithelium， infiltrated by neutrophils， and had a tendency to diffuse;The content of IL-2， IL-6， TNF-α and IFN-γ in the serum were significantly higher than the control group（P<0.05）， However， the mixed bacterial solution of Escherichia coli and Salmonella did not cause salpingitis， and there was no difference compared with the control group. The results of this test showed that the introduction of 30% phenol glue into the uterus of the fallopian tube could establish a good salpingitis model， which was better than the mixed bacterial liquid model of Escherichia coli and Salmonella.

Keywords： Laying hen; Salpingitis; Modeling; Verification