外源性硫化氢对断肢冷保存过程中缺血损伤的保护作用研究

鲍海力，刘浩，傅志仁，杨璟辉

近年来，随着显微外科和显微技术的不断进 步，断肢再植手术日渐成熟，适应证也随之扩大，一部分原来无法再植的肢体也可以保留并恢复一定功能。影响断肢再植手术成活率和术后断肢功能恢复最重要的因素就在于断肢的保存，包括保存时间和保存条件等。一方面，战争冲突往往发生在远离后方医疗单位的偏远地区或远海岛礁；另一方面，许多战创伤的战士多会伴有颅脑外伤、胸腹部多发伤等需要紧急救治的状况，需要转运至后方医院才能够接受手术治疗。然而，离体的肌肉组织在常温下缺血6～8 h 就会形成不可逆的损伤，导致永久性的残疾［1-3］。因此，如何最大程度地保存离体断肢的功能，同时尽可能延长断肢离体的保存时间，对于断肢再植手术的成功具有重要意义。

硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是近年来发现的一种能够内源性生成的新型气体信号分子，在人类和小鼠体内都会内源性低浓度地产生，并表现出传递细胞信号、扩张血管以及抗炎的特性［4-5］。有研究表明，在保存液中加入外源性H2S 可以改善移植物的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）并提高移植物的存活率［6-8］。高渗枸橼酸盐腺嘌呤（HC-A）保存液是一种在临床广泛使用的器官保存液。本研究将离体断肢保存在添加了H2S 供体硫氢化钠（NaSH）的HC-A 器官保存液中，旨在研究外源性H2S 对断肢冷保存过程中缺血损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 保存液及其配制 HC-A 保存液（上海长征医院提供）；NaHS（上海生化试剂公司产品）；本研究在HC-A 保存液中加入150 μmol/L NaHS（即5.1 mg/L H2S）。1.2 实验动物与分组 选用6～8 周C57/B6 健康雄性小鼠，体重（22 ± 5）g，采用数字表法随机将其分成3 组，每组8 只。分别为干燥冷藏保存（对照）组、HC-A 保存液（HC-A）组以及含有H2S 的HC-A保存液（H2S）组。

1.3 断肢的分离和保存 用4%水合氯醛按10 ml/kg腹腔注射麻醉C57/B6 小鼠，用剪刀离断小鼠后肢股骨上段，取得断肢。将取得的小鼠断肢常温放置半小时后，按分组方式分别置于干燥环境、HC-A 保存液和加了H2S 的HC-A 保存液中，并全部在4°C的环境中保存36 h。

1.4 样本获取及HE 染色 保存36 h 后，将各组断肢取出，从断肢股四头肌切取约1 cm×1 cm×1 cm的肌肉组织样本，放入4%的多聚甲醛中固定，并用石蜡包埋，切成4 μm 的薄片，行苏木素-伊红（HE）染色，之后于倒置光学显微镜下观察肌肉组织样本形态结构的改变。随机选取股四头肌中央部分，观察肌纤维和半球形肌纤维的数量，并用图像分析系统Image J 分析损坏的肌纤维百分比。

1.5 透射电镜检测肌肉组织超微结构 取3 组用不同保存方式分别保存36 h 后的小鼠断肢股四头肌组织块，迅速修剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小并迅速放入4°C 电镜固定液中4 h，进行漂洗后固定、脱水、渗透、包埋、切片及染色，然后在透射电子显微镜（HITACHI）下观察组织超微结构并采集图像进行分析。

1.6 免疫荧光检测 将小鼠肌肉石蜡切片依次脱蜡水化，抗原修复液（改进型柠檬酸钠抗原修复液）修复，BSA 封闭液室温封闭30 min，加入一抗［微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）1∶500］4°C 避光过夜，相应二抗（山羊抗兔1∶100）室温孵育50 min，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核，抗荧光淬灭封片剂封片。在倒置荧光显微镜（日本尼康）下观察并采集图像。每张切片在相同区域选5 个视野，计数LC3 阳性细胞比例。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用百分比（%）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织学分析肌肉样本 在对照组的肌肉样本中，可以观察到高水平的肌肉纤维损伤和大量的肌肉细胞坏死。在HC-A 组和H2S 组的肌肉样本中也可见部分肌肉纤维损伤和局部区域肌肉细胞坏死；但H2S 组肌肉组织的肌纤维损伤百分比显著低于HC-A 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1及表1。

表1 各组肌肉组织损伤的肌纤维占比比较（%）

图1 各组肌肉组织的病理图（HE×20）

2.2 透射电镜观察肌肉超微结构损伤 在透射电子显微镜观察到的结果和光镜下组织病理结果一致。在对照组中发现骨骼肌肌节几乎全部破坏，呈碎片状，无法辨认各线、带，线粒体（M）体积增大，呈空泡状改变。HC-A 组中部分骨骼肌肌节被破坏，成片状，部分肌原纤维结构消失或块状聚集，各线带不整齐，线粒体（M）大部分分嵴消失，出现空泡样变性。而H2S 组的骨骼肌样本结构基本清楚，局部可见肌节破坏，各线、带结构基本整齐，线粒体（M）轻度肿胀，线粒体嵴和线粒体膜结构基本完整。见图2。

图2 各组透射电镜下观察骨骼肌超微结构变化（标尺：上方图为50 μm，下方图为10 μm）

2.3 H2S 对LC3 蛋白表达的影响 LC3 蛋白是自噬特异性标志物，存在于自噬小体的表面，LC3 水平可以反应自噬小体的数量。在LC3 特异性免疫荧光的结果中可以观察到，H2S 组的LC3 阳性细胞（绿色荧光）数量较HC-A 组显著增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3 和表2。

表2 各组LC3 阳性细胞比例比较（± s）

表2 各组LC3 阳性细胞比例比较（± s）

注：与对照组比较aP＜0.01，与HC-A 组比较bP＜0.01

组别对照组HC-A 组H2S 组LC3 阳性细胞比例16.89%±2.69%32.25%±3.95%a 60.98%±8.61%ab例数888

图3 各组LC3 免疫荧光染色结果

3 讨论

当前临床上用于保存断肢的方法主要用干燥冷藏法，该方法是将断肢用含生理盐水的纱布包裹并迅速置入干燥的低温环境［9］。离体断肢的保存方法已经在很长一段时间内都没有得到发展，但是离体断肢的保存在研究中却得到广泛的关注，包括选用器官保存液、最适温度、移植前对组织进行灌注等［10］。许多研究也已经在动物实验中证明，使用器官保存液保存离体断肢可以降低离体断肢肌肉、皮肤、神经组织的损伤水平，减轻断肢再植后的肢体IRI，提高断肢手术的存活率［11］。本次实验也证实，器官保存液对于断肢离体后的保存具有良好的保护作用。

H2S 是第3 种内源性气体信号分子，在哺乳动物的体内可以内源性生成，并在多种生理和病理条件下发挥着重要作用。外源性的H2S 治疗也已被证实可以通过减轻IRI 引起的氧化应激、炎性反应、细胞凋亡和线粒体功能障碍等途径来减少IRI 对移植物的影响［12-13］。同时，有证据表明外源性H2S 可以在许多疾病中诱导自噬而发挥作用，比如H2S 可通过诱导保护性自噬降低结肠上皮细胞的增殖［14］。自噬是一种在进化上高度保守的生物学过程，能够降解细胞内功能障碍的细胞器和受损的蛋白质，以提高细胞在应激条件下的生存能力［15］。自噬是一个非常复杂的过程，涉及非常多的分子，典型的分子包括Beclin-1 和LC3 蛋白。LC3 是自噬一个特异性的蛋白，LC3 蛋白的表达增高，可以直接反应出细胞自噬水平的升高。已经有许多研究表明自噬在肢体的缺血再灌注损伤中也发挥着一定的调控作用［16-17］。

本研究表明，在离体断肢的保存液中加入H2S后可以通过促进自噬发挥保护作用。加了H2S 的HC-A 保存液中的断肢在光镜病理表现出组织损伤减轻，肌纤维断裂减少。与此一致的是，在透射电镜下也观察到H2S 组的骨骼肌组织纤维结构损伤轻微，线粒体结构更为完整。线粒体是细胞内对致伤因子十分敏感的细胞器，所以线粒体的形态改变通常作为细胞损害的重要标志。透射电镜和HE 的检测结果一致说明，相较于单纯HC-A 保存液组，加入了H2S 的HC-A 保存液表现出对断肢骨骼肌良好的保护作用。随后，在进一步的研究中发现，这种保护作用和自噬的增加有关。正常生理情况下，机体的自噬都处在一个较低的基础水平，以维持机体的内环境稳态，但是在内部或者外部的刺激下，如缺血、炎症等情况下，自噬水平会发生上调［18］。同样，有研究证明，自噬水平的增加能延缓轻度缺血应激时细胞凋亡和坏死的发生，在细胞生存中起着重要作用［19］。Dai 等［20］研究发现，升高的自噬水平也可以通过促进细胞凋亡和抑制基质小泡的释放，对磷酸诱导的血管平滑肌细胞钙化发挥保护作用。本研究发现，H2S 组的离体断肢较HC-A 组的断肢表现出更高水平的自噬，同时离体断肢肌纤维的损伤程度更小。

综上所述，HC-A 器官保存液可以在断肢长时间的离体保存中发挥保护作用，而在该保存液中加入了H2S 后，H2S 可以通过上调骨骼肌细胞的自噬水平，在断肢缺血损伤的过程中发挥保护作用，具有在临床和军事领域应用的潜力。