干扰circRNA_002178抑制胶质瘤细胞恶性生物学行为①

高雪亮 张皓翔 程建业 贾培雷 赵亚鹏 （河北省中医院神经外科，石家庄 050000）

胶质细胞瘤是一种常见的神经上皮组织肿瘤，具有生长快、侵袭性强、预后差、恶性程度高等特点［1］。传统的治疗是通过外科手术结合术后同步放射治疗和药物化疗，近年来转变为致病基因和调控分子的靶向治疗［2］。环状RNA（circRNA）是一种共价闭环结构的非编码RNA，在生物细胞中广泛表达［3］。具有普遍性、稳定性、保守性和特异性，随着分子生物学的发展，研究显示circRNA 在肿瘤组织中的表达有特异性差异，在肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移中担任关键角色，其不仅可作为肿瘤诊断和预后生物标志物，还可作为治疗的潜在靶点，发挥肿瘤抑制因子或启动因子效应［4］。但未见circRNA_002178 对胶质瘤的影响，因此，本实验探讨干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、炎症反应的影响，以期为胶质瘤的临床治疗提供实验参考。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 临床样本 收集2015 年6 月至2019 年1 月进行手术的胶质瘤患者的癌症组织及癌旁组织25 对（术前未进行放化疗治疗的患者）。组织标本取材后置于-80 ℃超低温冰箱中保存。受试者知晓本研究内容并签署同意书，本研究经河北省中医院伦理委员会批准。

1.1.2 实验细胞 人胶质瘤细胞U-251 购自中国科学院上海细胞库。

1.1.3 主要试剂 RPMI1640 培养基、胎牛血清、青/链霉素溶液购自美国Gibco 公司；胰蛋白酶购自北京索莱宝公司；mRNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒购自上海研拓生物科技有限公司；Transwell 侵袭小室购自北京优尼康生物科技有限公司；CCK8 细胞增殖试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司；AnnexinV-FTTC/PI 细胞凋亡检测试剂盒购自美国Centrebio 公司；Bax、Bcl-2、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等相关抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；IL-6、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-10 试剂盒购自上海酶联生物公司。

1.1.4 主要仪器 QP-80 二氧化碳细胞培养箱购自济南鑫贝西生物技术有限公司；CytoFLEX 流式细胞仪购自美国Beckmancoulter 贝克曼库尔特公司；Multiskan GO 酶标仪购自美国Thermo 赛默飞公司；TGL-16M 台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪离心机仪器有限公司；SW-CJ-1C无菌尘净化操作台购自上海尚净公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取出冻存的U-251 细胞，水浴锅解冻处理后，转移至含10%胎牛血清、1%青/链霉素溶液的RPMI1640 培养基中，将细胞悬液置于细胞培养箱中进行培养，培养条件为37 ℃，5%CO2，饱和湿度；当细胞融合度为80%左右时，采用胰蛋白酶消化为单细胞悬液，传代培养，取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染与分组 将胶质瘤U-251 细胞随机分为空白对照组（Control）、阴性对照组（shRNANC）、干扰组1（circRNA_002178-shRNA1）、干扰组2（circRNA_002178-shRNA2）、干 扰 组3（circRNA_002178-shRNA3）。其中，空白组加等体积培养液，其余各组根据Lipofectamine 2000TM说明书分别进行转染。

1.2.3 RT-qPCR 检测 分别取癌组织和癌旁组织的临床样本，剪碎研磨成匀浆后，加入1 ml Trizol 试剂提取总RNA，离心后转移上清液，加入氯仿混匀，室温静置3 min 后离心，转移上清液，加入异丙醇混匀离心后弃上清液，用75%乙醇洗涤，真空干燥后进行逆转录，加入相应引物及样品，采用2-ΔΔCt法计算circRNA_002178的相对表达水平，实验重复3次。

取转染处理后的各组细胞，将细胞稀释至5×104个/ml，置于培养箱中24 h，弃培养液，采用Trizol 试剂提取细胞样品中的总RNA，进行反转录，加入相应引物，采用2-ΔΔCt法计算circRNA_002178和VEGF mRNA 的相对表达水平，实验重复3 次。circRNA_002178-shRNA1 正 向 引 物：5′-AGCCCGGGAAGGCGGAGAGAG-3′，反向引物：5′-GCTCGGGGGCCCTGTTGG-3′；circRNA_002178-shRNA2 正向引物：5′-CTGAGCTTCGGGGAGCTGAGT-3′，反向引 物：5′-GCTTCGGGGAGCTGAGTGCGT-3′；circ-RNA_002178-shRNA3 正向引物：5′-CCAATGCTACAGTCGTTACG-3′，反向引物：5′-CCGGCTTTAACGTCGACCTG-3′；VEGF 正向引物：5′-ACCATGAACTTTCTGCTGTCTTG-3′，反向引物：5′-ATGGCTTGAAGATGTACTCGATCTC-3′；GAPDH 正向引物：5′-GGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTC-3′，反 向 引物：5′-GTACTCAGCGGCCAGCATCG-3′。

1.2.4 CCK8 检测细胞增殖率 将转染后的各组细胞以3×103个/孔接种于96 孔板，置于培养箱中培养48 h，加入10 μl 的CCK8 试剂，培养箱孵育2 h后，于450 nm 波长处采用酶标仪检测各孔的吸光度值，实验重复3次。

1.2.5 克隆形成法检测细胞形成率 将转染后的各组细胞以5×104个/ml 接种于6 孔板，置于培养箱中培养24 h 后，PBS 溶液洗涤细胞2 次，用4%的多聚甲醛溶液固定细胞20 min，弃固定液，0.1%结晶紫溶液染色15 min，洗去染色液，室温晾干。拍照观察，软件计数，并计算克隆细胞形成率，实验重复3次。

1.2.6 流式检测细胞凋亡水平 将转染后的各组细胞以5×106个/孔接种于96 孔板，离心后弃培养基，PBS 洗涤2 次，弃上清液，加入Annexin V-FTTC溶液重悬细胞，避光孵育10 min，离心弃上清液，PI冰盒中避光孵育10 min，洗去染色液，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实验重复3次。

1.2.7 Western blot 检测蛋白表达水平 将转染后的各组细胞以5×106个/孔接种于96 孔板，加入裂解液处理，离心后收集上清液，BCA 法检测细胞蛋白液浓度。取待测蛋白与上样缓冲液孵育，加热变性后，将蛋白添加至SDS-PAGE 凝胶上样孔中，调节电压，进行转膜、封闭、一抗、二抗等操作，TBST溶液洗涤后，采用ECL 法显影，并拍照记录实验数据，实验重复3次。

1.2.8 Transwell 检测细胞侵袭 将基质胶均匀铺于细胞侵袭小室，置于24孔细胞培养板。在上室中加入细胞培养基（200 μl/孔），培养孵育1 h。将各组胶质瘤细胞接种于上室；在下室中加入400 μl 含胎牛血清的细胞培养基，培养12 h。漂洗固定后，用1%结晶紫染液处理30 min，显微镜下观察侵袭细胞，并拍照记录。

1.2.9 ELISA 检测血清炎症因子IL-6、iNOS、IL-10含量 取各组对数生长期细胞，冰上加入细胞裂解液处理，离心取上清。根据试剂盒说明书操作，分别取50 μl 样品置于酶标孔板底部，混匀封膜，孵育30 min。甩干并洗涤，重复3 次。加入50 μl 酶标试剂，孵育30 min，洗涤5 次，加入显色液，避光孵育15 min，加入终止液，于450 nm处检测吸光度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0 软件进行分析，选择单因素方差分析（One-Way ANOVA），数据用表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA_002178 在胶质瘤、癌旁组织及不同shRNA 序列中表达的影响 胶质瘤组织circRNA_002178 表达水平明显高于癌旁组织（P＜0.05，图1A），因此，选用胶质瘤细胞U-251 进行后续实验。在转染不同的shRNA 片段后，与Control 组相比，shRNA-NC 组circRNA_002178 表达差异无统计学意义，与shRNA-NC 组相比，3 个干扰组circRNA_002178 表达均明显降低，其中circ_002178-shRNA2组干扰效果最为明显（P＜0.05，图1B）。因此，选择此组作为后续实验干扰组。

图1 circRNA_002178 在胶质瘤、癌旁组织及不同shRNA序列中的表达Fig.1 Expressions of circRNA_002178 in glioma，adjacent tissues and different shRNA sequences

2.2 干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞增殖的影响 与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞增殖率差异无统计学意义，与shRNA-NC 组相比，circ_002178-shRNA2 组胶质瘤细胞增殖率明显降低（P＜0.05，图2A）；与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞克隆形成率差异无统计学意义，与shRNANC 组相比，circ_002178-shRNA2 组胶质瘤细胞克隆形成率明显降低（P＜0.05，图2B、C）。提示干扰circ-RNA_002178对胶质瘤细胞的增殖具有抑制作用。

图2 干扰circRNA_002178对胶质瘤细胞增殖的影响Fig.2 Effect of interference circRNA_002178 on proliferation of glioma cells

2.3 干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞凋亡的影响 与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞凋亡率差异无统计学意义，与shRNA-NC 组相比，circ_002178-shRNA2 组胶质瘤细胞凋亡率明显升高（P＜0.05，图3A）；与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞Bax/Bcl-2 蛋白表达差异无统计学意义，与shRNA-NC 组 相 比，circ_002178-shRNA2 组 胶 质 瘤细胞Bax/Bcl-2 蛋白表达明显升高（P＜0.05，图3B）。提示干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞凋亡率及Bax/Bcl-2 蛋白表达具有促进作用，对细胞具有诱导凋亡的作用。

图3 干扰circRNA_002178对胶质瘤细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of interference circRNA_002178 on apoptosis of glioma cells

2.4 干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞侵袭的影响 与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞中VEGF 蛋白及mRNA 的表达差异无统计学意义；与shRNA-NC 组 相 比，circ_002178-shRNA2 组 胶 质 瘤细胞中VEGF蛋白及mRNA表达明显降低（P＜0.05，图4A、B）；与Control 组相比，shRNA-NC 组侵袭细胞数差异无统计学意义，与shRNA-NC 组相比，circ_002178-shRNA2 组侵袭细胞数明显减少（P＜0.05，图4C）。提示干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞侵袭具有抑制作用。

图4 干扰circRNA_002178对胶质瘤细胞侵袭的影响Fig.4 Effect of interference circRNA_002178 on invasion of glioma cells

2.5 干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞炎症因子的影响 与Control 组相比，shRNA-NC 组胶质瘤细胞炎症因子表达差异无统计学意义，与shRNA-NC组相比，circ_002178-shRNA2 组胶质瘤细胞促炎因子IL-6、iNOS 水平明显降低，抗炎因子IL-10 水平明显升高（P＜0.05，图5）。提示干扰circRNA_002178对胶质瘤细胞炎症因子具有抑制作用。

图5 干扰circRNA_002178对胶质瘤细胞炎症因子的影响Fig.5 Effect of interference circRNA_002178 on inflammatory factors in glioma cells

3 讨论

胶质瘤是具有强侵袭性的恶性肿瘤，患者预后不良，积极治疗的中位生存期仅为1年，五年病死率超过95%。当前的治疗策略和治疗水平上取得了相当大的进步，但临床结果仍令人遗憾［5］。circ-RNAs 在胶质瘤中差异表达，并与神经胶质瘤分期相关，基于稳定性和circRNAs 的高保守，circRNAs可能是胶质瘤治疗的潜在分子靶点［6］。其中，circ-RNA_002178 在促进或抑制肿瘤的发生发展中发挥重要作用，例如circRNA_002178 在肺腺癌中作为ceRNA 促 进PD-L1/PD1 表达［7］；circRNA_002178 通过激活Akt/mTOR 通路促进口腔鳞癌细胞的增殖和迁移［8］；干扰circRNA_002178 抑制COL1A1 表达，从而延缓乳腺癌进展［9］，但circRNA_002178 对胶质瘤的影响尚未明确，因此，本研究对二者的关系进行探讨。

细胞凋亡在胚胎发育、功能完善、内环境稳定等方面发挥重要作用；当细胞凋亡功能受到抑制时，将导致肿瘤的发生及免疫功能的异常［10］。因此，抑制肿瘤细胞增殖、促进其凋亡具有重要意义，例如，替莫唑胺通过调控促凋亡蛋白Bax及caspase-3的表达上升，抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达下降，发挥缓解胶质瘤的作用［11］；过表达RNA SNORD44激活caspase依赖的凋亡途径，促进细胞凋亡，进而抑制胶质瘤细胞的增殖，侵袭和迁移［12］；干扰circMAN2B2 的表达抑制胶质瘤细胞增殖、侵袭、迁移，诱导其凋亡，可显著降低肿瘤大小，缓解病情进展［13］。本研究结果显示，干扰circ_002178 促进胶质瘤细胞的凋亡率及Bax/Bcl-2 蛋白表达。结果提示，干扰circ-RNA_002178对胶质瘤细胞具有诱导凋亡的作用。

VEGF 能够诱导单核细胞聚集，抑制内皮细胞凋亡，促进内皮细胞的生长及血管基质的成熟，加速新生血管形成，有利于肿瘤的生长，并诱导癌细胞的侵袭和转移［14］，因此，VEGF 是恶性肿瘤生长运动的必要条件。BHATTACHARYA 等［15］研究表明，VEGF 信号传导介导大肠癌细胞的迁移和侵袭；CELLA 等［16］研究显示，miRNA-451通过靶向CAB39，通过mTOR/HIF-1α/VEGF 信号通路抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭；此外，VEGF 可作为潜在的治疗靶点来改善疾病预后，例如在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等方面［16-19］。本研究结果显示，干扰circ_002178 可抑制胶质瘤细胞VEGF 蛋白及mRNA 的表达，并减少侵袭细胞数量。提示干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞侵袭具有抑制作用。

炎症因子是肿瘤微环境的重要组成部分，与肿瘤的发生、发展、转移和侵袭关系密切［20］。IL-6、iNOS、IL-10 均是生物体内炎症反应的敏感指标。其中，iNOS 是体内NOS 活性氧自由基产生的催化酶，反映体内的炎症程度，在病理状态下作为炎症介质，参与介导炎症细胞凋亡等病理生理过程［21］。研究表明，炎症因子IL-6 和TNF-α 在辅助诊断卵巢癌方面具有较高价值［22］。本研究结果显示干扰circ_002178 可下调胶质瘤细胞IL-6、iNOS 水平，上调IL-10 水平。提示干扰circRNA_002178 对胶质瘤细胞的炎症因子具有抑制作用。

综上所述，干扰circRNA_002178 可抑制胶质瘤细胞的增殖、侵袭、炎症反应，诱导其凋亡。干扰circRNA_002178 能够有效抑制胶质瘤细胞的恶性生物学行为，有望成为治疗胶质瘤的新靶点。