双波长HPLC法同时测定夏枯草中8种成分的含量

孙梦秋，佘胜楠，周丽红，成家禧，冯春来

(江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

夏枯草药材为唇形科植物夏枯草(PrunellavulgarisL.)的干燥果穗，其性寒，味辛、苦，归肝、胆经，具有清肝泻火，散结消肿等功效[1]。现代研究表明，夏枯草中主要含有萜类、酚酸类、黄酮类、香豆素类等多种活性成分[2-3]，具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等广泛的药理作用[4-5]。2020年版中国药典中以迷迭香酸为夏枯草中成分含量控制的指标，而对其他活性成分的含量控制未有明确规定。目前，已有研究分别对夏枯草中主要的三萜类成分、酚酸类及黄酮类成分等进行了含量测定[6-7]。方罗等[8]建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定夏枯草中熊果酸、齐墩果酸、咖啡酸、迷迭香酸4种活性成分的含量。黄兹英等[9]建立HPLC法对夏枯草中主要黄酮类成分芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山柰酚的含量进行同时测定。皮胜玲等[10]采用超高效液相色谱法对不同生长期夏枯草中差异较大的3种酚酸类成分进行含量检测。但未见有文献报道使用HPLC同时测定夏枯草中咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素。本实验采用双波长HPLC法测定夏枯草中8种活性成分，能够高效简便地对夏枯草中多种成分的含量同时进行检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；BSA124S型电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。东莨菪内酯对照品购自上海源叶生物科技有限公司，咖啡酸、对香豆酸、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素购自上海麦克林生化科技有限公司，质量分数 ≥ 98%；夏枯草药材购自河南(批号：20210116、20210822)、湖北(批号：20210906)、江苏(批号：20210926)、四川(批号：20220111)、安徽(批号：20220103)等不同产地，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为唇形科植物夏枯草的干燥果穗；乙腈和乙酸(色谱纯)购自国药集团，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素对照品各5 mg，以甲醇溶解并稀释至5 mL，制成质量浓度均为1 mg/mL的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，用甲醇稀释成8个成分浓度均为100 μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 取夏枯草药材适量，粉碎，精密称取1 g夏枯草粉末，置具塞锥形瓶中，按照料液比为1 ∶10加入50%乙醇10 mL，称重，40 ℃超声(功率250 W，频率40 kHz)提取40 min，放冷至室温，再称重，用50%乙醇补充失重，摇匀，3 700 r/min离心10 min后取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为InertSustainTMODS-C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%乙酸水溶液(B)，梯度洗脱体系为0～30 min，10%～25% A；30～50 min，25%～45% A；流速为1 mL/min；进样量为20 μL；柱温为30 ℃；检测波长为325 nm(咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸)和360 nm(秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素)。

1.2.4 线性关系考察 精密吸取“1.2.1”项下混合对照品溶液适量，用甲醇依次稀释成8种成分浓度均为1、5、10、50、100 μg/mL的混合对照品溶液。按照“1.2.3”项下色谱条件依次进样测定，记录峰面积。

1.2.5 精密度试验 精密吸取低(5 μg/mL)、中(50 μg/mL)、高(100 μg/mL)三个浓度的混合对照品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件每个浓度重复进样3次，记录峰面积，计算相对标准偏差(RSD)值。

1.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号：20210116)，室温下于0、4、8、12 h按“1.2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD值。

1.2.7 重复性试验 取同一夏枯草粉末(批号：20210116)6份，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算RSD值。

1.2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一夏枯草粉末(批号：20210116)6份，每份1.0 g，分别精密加入8个对照品适量(与1.0 g样品中各待测成分的量相当)，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算平均加样回收率及其RSD值。

1.2.9 样品含量测定 取不同产地夏枯草药材，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。

2 结果

2.1 色谱条件考察

按照“1.2.3”项下的色谱条件进样，混合对照品溶液及夏枯草供试品溶液的色谱图见图1。8种成分与其相邻色谱峰分离度均大于1.5，理论塔板数以各色谱峰计算均不低于5 000。

A： 混合对照品溶液(325 nm)；B： 夏枯草供试品溶液(325 nm)；C： 混合对照品溶液(360 nm)；D： 夏枯草样品溶液(360 nm)。1.秦皮乙素；2.咖啡酸；3.对香豆酸；4.东莨菪内酯；5.芦丁；6.金丝桃苷；7.迷迭香酸；8.槲皮素

2.2 线性关系考察

以对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数。结果表明8种成分在1～100 μg/mL浓度范围内与各自峰面积的线性关系良好(表1)。

表1 8种成分的线性关系考察结果

2.3 精密度考察

计算得到咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素在5 μg/mL浓度下的RSD分别为1.53%、1.49%、1.77%、1.69%、1.53%、1.76%、1.43%、1.67%；在50 μg/mL浓度下的RSD分别为1.48%、1.17%、1.17%、0.89%、1.75%、1.12%、1.36%、1.89%；在100 μg/mL浓度下的RSD分别为0.91%、1.78%、1.42%、1.24%、1.33%、0.71%、1.30%、1.55%。该8种成分在三个浓度下的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4 稳定性考察

计算得到咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的RSD分别为0.84%、0.96%、1.16%、0.25%、2.01%、1.99%、1.38%、2.22%，8个成分的RSD均小于3%，表明供试品溶液室温下放置12 h内稳定。

2.5 重复性考察

计算得到咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的RSD分别为1.91%、1.49%、2.19%、0.42%、2.62%、2.65%、1.20%、2.71%，8种成分的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.6 加样回收率考察

计算得到咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素的平均加样回收率分别为101.93%、99.20%、100.65%、98.63%、99.45%、101.39%、99.13%、102.36%；RSD分别为2.24%、2.50%、1.78%、1.64%、1.83%、2.08%、2.11%、1.57%。8个成分的平均加样回收率为98.63%～102.36%，RSD均小于3%，表明本方法准确性良好。

2.7 样品含量测定结果

分别计算不同产地夏枯草中8种成分的含量，结果见表2。实验结果表明，安徽产地的夏枯草中迷迭香酸、芦丁和金丝桃苷含量均较高，分别为5.240 mg/g、0.368 mg/g和0.195 mg/g；河南产地的夏枯草(批号：20210116)中咖啡酸、对香豆酸和槲皮素含量较高，分别为0.459 mg/g、0.023 mg/g、0.027 mg/g；江苏产地的夏枯草中东莨菪内酯含量最高，为0.098 mg/g；四川产地的夏枯草中秦皮乙素含量最高，为0.041 mg/g。

表2 不同产地与批号的夏枯草中8种成分的含量测定结果 mg/g

3 讨论

本实验在200～400 nm波长范围内对夏枯草中8种成分进行了紫外全波长扫描，其中在325 nm波长下咖啡酸、迷迭香酸有最大吸收，在360 nm波长下芦丁、金丝桃苷有最大吸收，其余4种成分在两个波长下均有吸收。其中秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷和槲皮素在360 nm下具有更好的线性关系，且在该波长下供试品中其他成分对该8种成分的干扰较小，基线更平稳，但对香豆酸在此波长下响应值较低；而在325 nm下对香豆酸、咖啡酸、迷迭香酸和东莨菪内酯吸收更强且线性关系更好。故选择325 nm和360 nm双波长同时测定该8种成分。

实验中曾采用水-甲醇、0.1%乙酸水-甲醇、水-乙腈、0.1%乙酸水-乙腈作为流动相，并分别考察了等度洗脱和不同梯度洗脱的方法，结果表明在梯度洗脱条件下，以0.1%乙酸水-乙腈作为流动相时，各成分的色谱峰分离效果较为理想，峰形均较好且无拖尾现象。

在预实验中分别考察了水、不同比例的甲醇和乙醇作为提取溶剂对夏枯草中8种成分提取含量的影响。经综合比较发现，50%的乙醇作为提取溶剂时效果最佳，该8种成分均可检测出，且其中咖啡酸、芦丁、迷迭香酸含量均较高。此外，研究结果表明，购自5个产地的夏枯草药材中均含有咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素，但不同产地的夏枯草中该8种成分的含量存在较大差异，可能与其生长环境不同以及采收季节的不同有关。

本研究建立了一种双波长条件下同时测定夏枯草中咖啡酸、对香豆酸、东莨菪内酯、迷迭香酸、秦皮乙素、芦丁、金丝桃苷、槲皮素8种成分的HPLC法。所建立的方法简单高效，准确可靠，重复性良好，为夏枯草的质量控制提供了有益参考。