芦丁在多壁碳纳米管修饰碳糊电极上的电化学行为及其与DNA的相互作用

尚永辉, 刘 彬，古元梓

(咸阳师范学院化学与化工学院,陕西咸阳 712000)

芦丁是一种自然界中常见的黄酮醇类化合物，多存在于烟叶、枣、杏、橙皮、番茄、荞麦花等植物中，具有抗炎、抗病毒、抗衰老、抗癌等多种功效[1,2]。目前文献报道芦丁的测定方法主要有高效液相色谱法[3]、毛细管电泳法[4]、流动注射化学发光法[5]等。脱氧核糖核酸(DNA)是生物体遗传信息的重要载体，与生物体的生长,发育以及病变过程息息相关，深入研究药物小分子与DNA的相互作用信息有助于从分子水平上了解生命现象的本质[6]。

本文探讨了芦丁在多壁碳纳米管修饰碳糊电极(MWCNTs/CPE)上的电化学行为，在此基础上研究了芦丁与DNA的相互作用信息。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660C型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；RF5301型荧光光谱仪(日本，岛津公司)；CH2250型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ520DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；三电极系统：MWCNTs/CPE为工作电极，Hg/Hg2Cl2电极为参比电极，铂电极为辅助电极。

1.0×10-3mol/L芦丁溶液：称取0.0305 g芦丁标准品(中国药品生物制品检定所)用乙醇在50 mL烧杯里搅拌至完全溶解，转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容备用。604 μg/mL DNA溶液：准确称取0.0151 g鲱鱼精DNA(fsDNA,美国Sigma公司)用蒸馏水完全溶解，定量转移至50 mL容量瓶中定容，0～4 ℃保存备用。1.0×10-3mol/L中性红溶液：称取0.0144 g中性红(纯度大于99%，上海试剂三厂)，用蒸馏水溶解，定量转移至100 mL容量瓶中定容，备用。实验用水为蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1修饰电极的制备称取适量石墨粉于研钵中，滴加液体石蜡并充分研磨，至呈有一定韧性的小片状，填入0.5 mL注射器中，压实，从另一端插入一根打磨过的铜丝作为导线，即制得碳糊电极(CPE)，将电极在称量纸上打磨抛光，备用。称取5 mg经混酸处理过的MWCNTs粉末(>98%,成都有机研究所)，加入5 mL DMF并置于试管中，用数控超声波清洗器进行超声分散2 h，使其均匀分散。取适量滴至抛光好的CPE上，红外灯烘干，备用。

1.2.2电化学测定准确移取一定量芦丁储备液于10 mL比色管中，加入pH=3.21的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液3.0 mL，用去离子水定容，以MWCNTs/CPE为工作电极，用三电极系统测定，记录循环伏安曲线和微分脉冲伏安曲线。

1.2.3光化学测定准确移取一定量的芦丁标准溶液，移取pH=3.21的Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液3.0 mL，加入一定量DNA溶液，定容到10 mL，摇匀，放置1 h后，用荧光光谱仪以306 nm为激发波长，狭缝宽度均为5.0 nm，测定350～750 nm的发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 芦丁在MWCNTs/CPE上的电化学行为

实验考察了芦丁分别在CPE和MWCNTs/CPE上的电化学行为，结果见图1。2.0×10-4mol/L芦丁在CPE以及MWCNTs/CPE两个电极上的氧化峰、还原峰电位均在0.508 V和0.438 V，峰电位无明显移动；但在修饰电极上的电流信号明显强于CPE，其中在修饰电极上的氧化峰电流信号是CPE上的2.15倍，还原峰电流信号是CPE上的1.95倍，表明对芦丁具有明显的催化作用。

2.2 实验条件优化

2.2.1最佳pH值实验考察了芦丁在不同pH的B -R缓冲溶液中的电化学行为，结果见图2。由图2可知：随着pH的增加，芦丁的氧化峰、还原峰峰电位均线性负移，其中氧化峰电位与pH的线性关系为:Epa=-0.0648pH+0.6997(r=0.9980)，表明芦丁在MWCNTs/CPE上的电极反应过程有质子参与，依据Epa=E0-0.059(m/n)pH，计算得到：m/n=1，即m=n，可知该电极反应过程为等质子等电子反应过程[7]。实验中pH=3.21时峰电流最大，且峰形最佳，实验选择pH为3.21。

2.2.2底液的选择实验考察了芦丁分别在pH=3.21的B -R、柠檬酸-柠檬酸钠、Na2HPO4-柠檬酸、邻苯二甲酸-HCl、HAc-NaAc 5种缓冲溶液中的电化学行为，结果见图3。研究发现芦丁在pH=3.21的Na2HPO4-柠檬酸缓冲体系中峰电流最大，峰形最好。实验选择pH=3.21 Na2HPO4-柠檬酸缓冲溶液为底液。

2.2.3扫描速率对电化学信号的影响实验进一步考察了扫描速率对芦丁电化学信号的影响，结果如图4所示。由图可知氧化峰电流、还原峰电流均随扫描速率的增大而增加，其中氧化峰电流ipa与v呈现良好的线性关系，线性方程为：ipa(μA)=-5.731v(V/s)-3.3926(r=0.9985)，表明芦丁在MWCNTs/CPE上的电化学氧化过程是受吸附控制的电极反应过程；氧化峰电位Epa与lnv呈良好的线性关系，线性方程

2.4 线性关系

在最佳实验条件下,采用循环伏安法测定，芦丁浓度在5.0×10-7～2.0×10-4mol/L范围内与其氧化峰电流ipa呈良好的线性关系，线性方程为：ipa(μA)= 4.77c芦丁(10-4mol/L)+1.4563(r=0.9990)，检出限为2.0×10-7mol/L，应用该方法测定5.0×10-6mol/L的芦丁溶液20次，相对标准偏差为4.58%。该方法具有灵敏度高，检出限低，线性范围宽，重现性好等优点，有望作为芦丁测定的新方法。

2.5 芦丁与DNA相互作用的研究

2.5.1芦丁与DNA相互作用的电化学行为在最佳实验条件下，固定芦丁浓度为1.0×10-4mol/L，加入一定量DNA溶液，待两者充分混合反应后，以MWCNTs/CPE为工作电极测定体系的微分脉冲伏安曲线，见图5。由图5可知，芦丁的氧化峰电流随DNA的加入明显降低，峰电位逐渐正移，依据Bard[10]等人的经验，推测芦丁与DNA主要以嵌入作用为主；从分子结构上看，芦丁的主体结构有多个羟基，为亲水基团，易于DNA上的碱基发生相互作用。

2.5.2以中性红为探针研究芦丁与DNA相互作用具有平面吩嗪环特征的中性红分子能与DNA发生嵌插作用[11]，为了进一步探究芦丁与DNA的相互作用机理，实验以中性红作为电化学探针进行研究。实验分别取一定量中性红、中性红与DNA，以及中性红、DNA和芦丁的混合溶液，静置反应30 min后，分别测定体系的微分脉冲伏安图(图6(a))和荧光光谱图(图6(b))。

由图6(a)可知，中性红在-0.4657 V处具有一灵敏的还原峰(图6(a)曲线1)，当加入DNA后，由于中性红与DNA的结合导致游离的中性红浓度降低，中性红电流随之降低(图6(a)曲线2)，继续加入一定量的芦丁后，中性红的峰电流又明显增强(图6(a)曲线3)；由图6(b)荧光图谱得到了类似的结果。这可能是由于芦丁与DNA的结合使体系中原来插进DNA双链碱基对中的中性红分子再次的游离出来，体系中游离的中性红浓度增加而导致其光电化学信号增强；芦丁能取代中性红与DNA产生相互作用，表明芦丁和中性红与DNA的相互作用方式及位点相同，进一步表明实验条件下芦丁能有效插进DNA双链的碱基对中间与DNA发生嵌插作用的结合。应用电化学实验数据按照文献方法[12]计算了芦丁与DNA的结合数m=1，两者的结合常数β=3.77×105L/mol。

3 结论

采用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了芦丁在多壁碳纳米管修饰碳糊电极上的电化学行为，在此基础上研究了芦丁与DNA的相互作用。实验发现多壁碳纳米管对芦丁具有明显催化作用，在pH=3.21的Na2HPO4-柠檬酸缓冲体系中芦丁能产生良好的电化学信号，芦丁在多壁碳纳米管修饰电极上的反应是受吸附控制的2质子，2电子反应过程，在此基础上研究DNA的加入对芦丁氧化峰的影响，发现芦丁能通过嵌入方式与DNA相结合。