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纳米槲皮素对MCF-7和MCF/ADR细胞耐药性影响研究

2019-01-15胡旭虎

绿色科技 2018年22期
关键词:槲皮素耐药性毒性

骆 滨,胡旭虎,王 强

(中南民族大学 药学院,湖北 武汉430074)

1 引言

槲皮素是一种具有代表性的生物活性黄酮醇。促细胞分化,诱导细胞凋亡[1~12]。不但能增强肿瘤细胞对多种药物的耐药性,并且与多柔比星、顺铂等抗肿瘤药物联合使用可有效提升抗肿瘤效果[1]。但由于槲皮素分子结构上的特点,决定了其不太适合于直接作为药品使用,近年来槲皮素的结构修饰和剂型改造工艺的增多,为其提供了非常好的研究机会[13~16]。槲皮素纳米粒,槲皮素脂质体,槲皮素固体脂质纳米粒,槲皮素胶束等是最常见的剂型[17~23]。纳米槲皮素晶体也可称为纳米槲皮素悬浮液。它是通过将纳米级的槲皮素微粒均匀分散在水溶液中以形成稳定的亚微米胶体分散体系。形成的纳米药物结晶粒径非常小,一般在10~1000 nm,当药物粒径降至微米甚至降至纳米级别时,其饱和溶解度会得到显著提升。然而,通常需要在溶液中加入聚合物或表面活性剂以稳定体系[24]。随着饱和溶解度的增加,药物的溶出速率也增加。因此纳米结晶不仅可以提高药物的溶出率,而且可以提高药物的饱和溶解度,从而提高像槲皮素等难溶性药物的口服利用度[25]。

2 实验部分

2.1 样品、试剂和仪器

槲皮素原料药(纯度99.0%,国药化学试剂有限公司)和对照品(中国国家药品生物制品检定所),胰蛋白酶(Gibco,USA),1640培养基(Gibco,USA),胎牛血清(Gibco,USA),CCK-8试剂(上海Beyotime),盐酸多柔比星(Aladdin),MCF-7细胞(北京协和细胞库),MCF/ADR细胞(北京协和细胞库),Tween-20(gibco,USA),Glycine(gibco,USA),P-糖蛋白抗体(Abcom,UK),β-action抗体(Abcom,UK),山羊抗兔二抗(Abcom,UK),RIPA裂解液(上海Beyotime),脱脂奶粉(上海Yuanmu),30%丙烯酰胺(PAEG,gibco,USA),Tris-HCl缓冲液(p H6.8和p H8.8,gibco,USA),十二烷基硫酸钠(SDS,gibco,USA),BCA蛋白试剂盒(上海Beyotime),小分子蛋白质标准Mark(Applygen公司),上样缓冲液(loading buffer,普利莱公司);TEMED(gibco,USA),Tris base(gibco,USA),其他试剂均为分析级,实验用水为去离子超纯水。ETSD4定时恒温磁力搅拌器(IKA,German),梅特勒-托利多PL203电子天平(Switzland),UV-1800型紫外分光光度汁(SHIMADZU,Japan),Millipore Direct8超纯水仪(MERCK MILLIPORE,German),Thermo fisher Nicolet iS10傅立叶红外光谱仪(thermo,USA),马尔文Zetasizer Nano S90纳米粒度分析仪(MalvernPanalytical),Vortex-Genie2涡旋振荡器(Scientific Industries,USA),梅特勒-托利多FE20型p H计(Switzland),超声波清洗机(GuangDong GT Ultrasonic Inoustrialco'ltd),ThermoSavant ISS110 P1型离 心 浓缩仪(thermo,USA),Thermo MICROCL21 R型冷冻离心机(thermo,USA),Thermo311型细胞培养箱(USA),吉尔森P型移液器系列(USA),CHRIST ALPHA_1-4 LD型冷冻干燥机(German),细胞计数器(南京汉龙实验设备有限公司),Thermo Multiskan FC型酶标仪(USA),奥林巴斯CKX41-A32 FL/PH型荧光倒置显微镜(Japan)。

2.2 制备纳米槲皮素

用电子天平精密称取0.5 g槲皮素粉末置于棕色称量瓶中,加入一定量NaOH溶液,密封避光搅拌放置24 h。然后缓慢加入0.12 mol/L HCl溶液,调节溶液至p H值7~7.5,停止滴定。将经p H值调节的槲皮素溶液浓缩至20 m L,得到浓度为25 mg/m L的槲皮素溶液。

2.3 纳米槲皮素粒度测量

将适量的纳米槲皮素溶液稀释至合适的倍数,并通过纳米粒度分析仪测量纳米槲皮素粒度分布和Zeta电位。

2.4 紫外光谱比较纳米槲皮素与乙醇及DMSO溶解的差异

称取适量的槲皮素粉末,用DMSO,水和无水乙醇溶解并稀释适当的倍数。使用相应的溶剂作为空白,并在200~800 nm的波长范围内进行UV扫描,并记录和比较紫外数据。

2.5 纳米槲皮素对两种肿瘤细胞的细胞毒性

取浓度为25 mg/m L的纳米槲皮素溶液,用配好的胎牛血清细胞培养液将其稀释成以下浓度梯度的溶液:0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/m L。将稀释好的每组纳米槲皮素溶液加入样品细胞孔板中并进行后续实验。同时以100μg/m L的浓度制备槲皮素DMSO溶液。再用上述细胞培养液按以下浓度梯度配置新的槲皮素溶液:0、1.25、2.5、5、10、25、50、100μg/m L。将每组浓度梯度的槲皮素溶液加入上述的样品细胞孔板中并进行后续实验。

2.6 纳米槲皮素对两种肿瘤细胞耐药性的影响

分别用含纳米槲皮素和普通的细胞培养液稀释盐酸多柔比星成相对应浓度梯度,加入各处理好的细胞孔中培养,然后从各个浓度组中取出3个平行孔。1 h后检测各孔的OD450值并记录,计算各组细胞的细胞活度值并绘制活度关系曲线。

2.7 纳米槲皮素对细胞吸收多柔比星的影响

用含有纳米槲皮素的细胞培养基稀释含有50μg/m L,100μg/m L的实验培养基。将MCF-7细胞和MCF/ADR细胞在细胞培养基中培养,接种对数期生长的细胞到六孔板(200000细胞/孔)中。在后续培养中取四个孔接种细胞并用含50μg/m L及100μg/m L的纳米槲皮素培养液分别培养48 h和72 h。取两个孔并在正常培养基中培养72 h后用PBS缓冲液清洗。以上各组各取一孔加入含多柔比星0.5μg/m L的细胞培养液,将另一组添加到正常培养对照中。后续培养后加入正常培养基,用488 nm波长荧光激发观察各孔中细胞内多柔比星的分布及强度然后拍照记录。计数10000个细胞,计算每个细胞中多柔比星的荧光强度值并绘图。

3 结果与讨论

3.1 纳米槲皮素结构表征

如图1所示,纳米级槲皮素的粒径大小几乎都在124 nm附近。制备纳米槲皮素粒度分布在100~200 nm之间,颗粒相对均匀。如表1所示,混悬液的Zeta电位为-32.9 m V,形成了一种相对稳定的悬浮系统。

图1 纳米级槲皮素粒度分布

表1 纳米级槲皮素Zeta电位值

3.2 紫外光谱比较纳米槲皮素与乙醇及DMSO溶解的差异

DMSO溶解的槲皮素溶液UV对照结果如图2(a)所示,水稀释溶液结果如图2(b)所示,无水乙醇溶解溶液结果如图2(c)所示,槲皮素在250 nm和375 nm波长附近具有明显吸收峰,并且UV吸收光谱非常相似。这表明以此方法制备的纳米槲皮素在溶液中的分子结构非常稳定,并未发生变化。

图2 DMSO(a)、纳米槲皮素水溶液(b)及乙醇溶解槲皮素(c)紫外吸收图谱

3.3 纳米槲皮素对两种肿瘤细胞的细胞毒性实验

纳米槲皮素对MCF-7细胞(A)和MCF/ADR细胞(B)的细胞毒性实验结果显示在图3中。以DMSO溶解的槲皮素细胞毒性实验如图4所示,结果表明制备的纳米槲皮素具有较低的细胞毒性,对MCF-7细胞的IC50值约为2 mg/m L,对MCF/ADR细胞的IC50值约为1.5 mg/m L,已知溶液中的DMSO量越多,对细胞的危害越大,若对DMSO溶液的量进行控制,槲皮素浓度便达不到要求,用含有0.5%DMSO的水溶液显然不能制备200μg/m L浓度的槲皮素溶液。而以纳米制剂形式存在的槲皮素则显著提高了溶解性,溶解浓度可达到4 mg/m L。

图3 纳米槲皮素对MCF-7细胞(A)及MCF/ADR细胞(B)的细胞毒性

图4 DMSO溶解槲皮素在MCF-7细胞(A)及MCF/ADR细胞(B)中的细胞毒性

3.4 纳米槲皮素对细胞耐药性影响实验

绘制的活动曲线如图所示。从图5可知,以多柔比星处理MCF-7细胞时,得到IC50值为1.75μg/m L而用50μg/m L槲皮素溶液处理后的MCF-7细胞的IC50值上升为3μg/m L,这表明槲皮素可显著提高MCF-7细胞对多柔比星的耐药性,图6也这表明用槲皮素处理的MCF/ADR细胞对多柔比星具有增强的抗性。这表明高浓度的槲皮素具有增加肿瘤细胞抗性的潜力。

图5 纳米槲皮素对MCF-7细胞耐药性的影响

图6 纳米槲皮素对MCF/ADR细胞耐药性的影响

3.5 纳米槲皮素对细胞吸收多柔比星的影响

图7和表2总结了每组多柔比星中观察到的MCF-7细胞的分布和荧光强度图。图8和表3总结了各组多柔比星中MCF/ADR细胞的分布和荧光强度图。从结果可以看出,细胞可吸收多柔比星,并且细胞核的荧光反应更强。槲皮素处理细胞的细胞内荧光强度明显弱于未处理组。并且结果表明高浓度的槲皮素可以以浓度和时间依赖性方式降低细胞内多柔比星的浓度。从图中还可以看出,高浓度的槲皮素处理后,2种肿瘤细胞的耐药性明显提升。通过计算每个细胞内多柔比星的荧光强度值可看出,细胞内荧光值与多柔比星的量成正比,荧光值越大,细胞毒性表现越明显。

图7 多柔比星及细胞流式仪检测多柔比星在各组MCF-7细胞内的分布及荧光强度

图8 多柔比星及细胞流式仪检测多柔比星在各组MCF/ADR细胞内的分布及荧光强度

表2 多柔比星在MCF-7细胞内的荧光强度

表3 阿霉素在MCF/ADR细胞内的荧光强度

4 结论

(1)通过考察槲皮素的结构特征,确定了纳米槲皮素最优的制备方法,制得的纳米槲皮素粒径小、溶解性提高。并红外光谱和紫外光谱证实该制备方法不会改变槲皮素分子结构。

(2)通过比较纳米槲皮素与DMSO溶解的槲皮素两种肿瘤细胞的毒性实验,已证实纳米槲皮素对MCF-7和MCF/ADR细胞具有较低的细胞毒性作用,其IC50值大于1.5 mg/m L。与DMSO溶解法相比具有更好的溶解性。并且经过纳米槲皮素处理的MCF-7和MCF/ADR细胞对多柔比星的耐受性明显提高。

(3)利用现有荧光分析方法和手段[26],可得知用高浓度槲皮素处理后的MCF-7细胞和MCF/ADR细胞内的多柔比星荧光强度明显减弱,这表明细胞内多柔比星的含量显著下降。

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