摩腹疗法对失眠大鼠食欲素及相关神经递质的影响※

高建辉 崔小锋 张超凡 屈玉疆 刘俊昌 王 程△

(1.新疆医科大学附属中医医院推拿科，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学中医学院针推骨伤教研室，新疆 乌鲁木齐 830000)

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取新疆医科大学动物实验中心Wistar大鼠共64只，雌雄各半，体质量(300±50)g，实验动物生产许可证号SCXK(新)2018-0002，饲养条件适宜，温度控制在18～22 ℃，通风及光线条件良好。

1.2 试剂及器械 戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)，Orexin-A检测试剂盒、多巴胺(DA)检测试剂盒、5-羟色胺(5-HT)检测试剂盒(武汉华美生物工程有限公司)，乙酰胆碱(Ach)检测试剂盒、去甲肾上腺素(NA)检测试剂盒、γ-氨基丁酸(GABA)检测试剂盒、组胺(HA)检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，食欲素受体拮抗剂Suvorexant(MK-4305)(大连美仑生物技术有限公司)。微量移液器(大龙医疗设备有限公司)，高速冷冻离心机(上海力申科学仪器制造厂)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司)，微量振荡器(江苏省金坛市医疗仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及造模 大鼠适应性喂养3 d，称质量编号后采用分层随机分组方法分为正常对照组、模型对照组、摩腹手法组、受体拮抗剂组，每组16只，雌雄各半。除正常对照组外，其余3组制备睡眠剥夺模型。造模期间每日8:00开灯，20:00关灯，采用自制改良平台水环境法：准备48个塑料圆桶，高度40 cm，桶口直径30 cm，并在其底部固定1个高度10 cm，直径6 cm的金属圆体水平台，圆桶内注水，水面低于水平台面约1 cm，水温保持在20 ℃左右，将正常对照组之外的其他3组大鼠放置在此造模平台上，每桶放1只大鼠，并将直径25 cm，网格大小1 cm的圆形金属网固定在距桶底25 cm处，金属网上放置饮用水和饲料，每日定期更换污水，连续造模8 d。采用戊巴比妥钠协同睡眠实验判定造模是否成功[12]。

1.3.2 干预方法 造模完成后立即进行如下操作：摩腹手法组大鼠仰卧位固定于外固定架上，操作者位于大鼠左侧，右手中指末节罗纹面作用于大鼠关元穴，通过肩关节在前外方向的小幅度环转，带动中指在大鼠腹部做环形平移摩擦。移动范围：鸠尾穴→带脉穴→关元穴→带脉穴→鸠尾穴的闭合圆环，5～7圈/min，顺、逆时针各操作5 min，每日操作1次，连续治疗2周。受体拮抗剂组予食欲素受体拮抗剂10 mg/kg灌胃，每日1次，2 h后固定于外固定架上予摩腹疗法，操作同摩腹手法组。正常对照组、模型对照组每日仅固定于外固定架上10 min，不进行任何操作。

1.4 观察指标及方法 ①4组大鼠干预2周后，各大鼠完全麻醉后腹主动脉采血2 mL，置于真空采血管，离心收集血清，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA、Orexin-A水平。②各大鼠依次断头处死，取脑组织，分离出下丘脑、脑干等组织，每只大鼠均取少量的下丘脑组织，匀浆后采用ELISA法检测GABA、HA、Orexin-A含量；各组取少量的脑干组织，匀浆后采用ELISA法检测DA、NA、5-HT、Ach含量。检测过程均严格按照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况 造模过程中摩腹手法组和受体拮抗剂组各脱落1只。模型对照组、摩腹手法组、受体拮抗剂组造模后大鼠出现明显的失眠症状：精神欠佳，毛发无光泽，易脱落，体质量减轻,对外界刺激敏感，易激惹，动物之间打斗频繁，攻击性增强，不时有动物从水平台掉落水中，昼夜规律颠倒；正常对照组精神良好，无明显攻击性，毛发润泽，行动正常。

2.2 各组大鼠血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA含量比较 与正常对照组比较，模型对照组血清DA、NA、Ach、HA含量均升高(P<0.05)，5-HT、GABA含量均降低(P<0.05)；与模型对照组比较，摩腹手法组和受体拮抗剂组DA、Ach含量均降低(P<0.05)，5-HT含量均升高(P<0.05)，NA、GABA、HA含量比较差异无统计学意义(P>0.05)；摩腹手法组与受体拮抗剂组组间各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清DA、NA、5-HT、Ach、GABA、HA含量比较

2.3 各组大鼠脑干DA、NA、5-HT、Ach含量比较 与正常对照组比较，模型对照组脑干DA、NA、Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量降低(P<0.05)，摩腹手法组、受体拮抗剂组Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量均降低(P<0.05)；与模型对照组比较，摩腹手法组脑干DA、NA、Ach含量和受体拮抗剂组脑干DA、NA含量均降低(P<0.05)，5-HT含量均升高(P<0.05)；摩腹手法组与受体拮抗剂组组间各检测指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠脑干DA、NA、5-HT、Ach含量比较

2.4 各组大鼠下丘脑GABA、HA含量比较 与正常对照组比较，模型对照组下丘脑HA含量升高(P<0.05)，GABA无变化(P>0.05)；模型对照组、摩腹手法组和受体拮抗剂组3组组间下丘脑HA、GABA含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠下丘脑GABA、HA含量比较

2.5 各组大鼠血清、下丘脑Orexin-A含量比较 与正常对照组比较，模型对照组血清、下丘脑Orexin-A含量均升高(P<0.05)；与模型对照组比较，摩腹手法组下丘脑Orexin-A含量降低(P<0.05)，血清Orexin-A含量无明显变化(P>0.05)，受体拮抗剂组血清、下丘脑Orexin-A含量均降低(P<0.05)；摩腹手法组与受体拮抗剂组组间血清、下丘脑Orexin-A含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠下丘脑、血清Orexin含量比较

3 讨论

现代医学认为，睡眠周期的产生与维持主要依赖于脑内的睡眠和觉醒系统，失眠的发病机制主要表现为脑皮质过度觉醒，即抑制性作用的减弱和易化性作用的增强[13]。Orexin系统作为觉醒启动区，对于觉醒系统，能分泌神经肽Orexin-A和Orexin-B促进脑区的觉醒[14-15]，增强大脑皮质对单胺能神经元功能活动的“易化”影响，促进单胺类神经递质(DA、NA、Ach、5-HT等)的分泌，从而维持觉醒状态[16]，其中DA、NA、Ach、HA递质促进大脑的觉醒，5-HT、GABA维持睡眠状态，Orexin 系统统一调控睡眠中枢与单胺能觉醒中枢，食欲素受体拮抗剂通过胃肠道吸收，阻断Orexin神经肽调控单胺类神经递质的分泌。本研究结果表明，与正常对照组比较，模型对照组血清DA、NA、Ach、HA含量均升高(P<0.05)，5-HT、GABA含量均降低(P<0.05)；脑干DA、NA、Ach含量均升高(P<0.05)，5-HT含量降低(P<0.05)；下丘脑HA、血清和下丘脑Orexin-A含量均升高(P<0.05)。提示改良平台水环境法建立的大鼠失眠模型影响血清和中枢神经的多种递质，并可增加觉醒启动区Orexin-A水平。与模型对照组比较，受体拮抗剂组血清DA、Ach含量均降低(P<0.05)，5-HT含量升高(P<0.05)；脑干DA、NA含量均降低(P<0.05)，5-HT含量升高(P<0.05)；血清、下丘脑Orexin-A含量均降低(P<0.05)。提示失眠模型大鼠灌胃食欲素受体拮抗剂后，Orexin-A含量在血清和下丘脑中均下降，并且对DA、NA、Ach、5-HT含量也产生影响。但是上述的结果与其他的研究有所差别，陈桦等[17]研究表明，失眠大鼠中枢神经系统组织中Orexin、NA的含量均升高，虽然与本实验研究结果相一致，但是5-HT的含量有差异，可能与2个实验取材的组织差异相关。对于睡眠系统，Orexin系统通过增加单胺神经能的兴奋来抑制GABA投射，从而抑制胆碱能神经元活性，维持睡眠状态，其水平降低可能与该神经递质的合成、传导、受体结合及降解相关。本实验研究表明，GABA在水环境造模及治疗中变化不大，唐汉庆等[18]研究表明，失眠大鼠血清中GABA的含量明显下降，而本实验因为样本不符合正态分布，选择秩和检验，也是两者实验存在差异的一个影响因素。

失眠属中医学“不寐”范畴。《难经》曰：“人之安卧，神归心，魄归肺，魂归肝，意归脾，志归肾，五脏各安其位而寝。”腹部推拿直接作用于腹部，依据中医经络脏腑学说，通过对腹部的经络腧穴进行推按和点穴，能够贯通身体上下气机，调节五脏六腑功能，从而起到治疗“不寐”的作用。“脑肠轴”是将胃肠道和中枢神经系统连接起来的神经-内分泌系统，有双向调节作用，一方面，高级神经中枢通过脑肠轴传递信号作用于胃肠道，并影响其感觉、动力及分泌；另一方面，胃肠道也可以通过该轴反作用到中枢神经系统，而推拿手法正是通过机械力作用于皮肤触压感受器，刺激内脏神经，使其发生编码作用和机械能转换为电能的过程，并产生电冲动传导至中枢神经[19]。赵祥等[20]研究表明，腹部推拿手法可以提高肠动力障碍兔模型肠道Ach神经纤维的含量；脏腑推拿手法不仅可以改善局部微循环，还刺激椎前神经节,以减轻交感神经兴奋的症状，并能减少NA对交感神经的影响[21]；摩腹疗法可以即刻激活兔模型的丘脑，累积后逐渐扩展到扣带前回和脑岛皮质[22]，以上说明腹部推拿手法可以通过脑肠轴来影响中枢神经系统。而本研究结果显示，与模型对照组比较，摩腹手法组血清DA、Ach和脑干DA、NA、Ach含量均降低(P<0.05)，血清和脑干5-HT含量均升高(P<0.05)，下丘脑Orexin-A含量降低(P<0.05)，提示摩腹手法治疗失眠模型大鼠疗效确切，可明显改善血清和脑干多种神经递质水平，降低下丘脑Orexin水平。

综上所述，摩腹疗法治疗失眠大鼠的机制可能是摩腹疗法降低外周血清和中枢神经系统的Orexin水平，进而兴奋5-HT能神经元，抑制NA、DA、Ach能神经元来实现的，这为临床中推广使用摩腹疗法治疗失眠提供了实验依据和理论基础。此外，本实验仍存在一些不足，本次实验只研究了对Orexin和神经递质的影响，缺少大脑电活动及电位变化，以及相关靶点如何影响神经递质尚待进一步研究，本次研究可能只涉及其中的部分机制，后续将在现有基础上开展进一步研究。