祛瘀通络解毒方联合中药外治方对糖尿病足溃疡面局部组织活化素Ⅰ型受体和人矮小同源盒基因2表达的影响※

刘宇彪 周花玩 鞠 上

(1.中国中医科学院广安门医院南区外科，北京 102600；2.北京金象复星医药股份有限公司天承金象中医诊所，北京 100045；3.北京中医药大学东直门医院周围血管病科，北京 100061)

糖尿病足是由于糖尿病患者并发周围神经病变或下肢动脉血管病变，导致的足部缺血性、神经性或神经缺血性病变，在病程进展中可导致足部溃疡，创面迁延不愈，严重者引起足部组织坏死而有截肢风险[1]。目前临床多以控制血糖、改善微循环、营养神经、抗感染等对症治疗为主，效果并不理想[2]。中药治疗糖尿病足溃疡具有显著效果，可改善患者临床症状，促进创面愈合，且具有更高的安全性[3]。近年来多项研究表明，活化素Ⅰ型受体(activin A receptor type Ⅰ，Acvr1)、人矮小同源盒基因2(short stature homeobox 2，Shox2)与肢体发育及创面愈合密切相关[4-5]。Acvr1在肌细胞、血管、足骨及真皮细胞发育中具有重要作用，其表达异常时可影响多种疾病的发生和预后[6]。Shox2是胚胎发育的关键基因，不仅在肢体形成中起关键作用，对软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和真皮成纤维细胞等多种结缔组织细胞的发育和形成也具有重要作用[7-8]，且有研究发现人类的皮组织中Shox2呈高表达[9]。本研究基于中医学对糖尿病足溃疡病因病机的认识，结合临床实践经验，以祛瘀通络解毒方内服联合中药外治方熏洗治疗糖尿病足溃疡58例，并与中药外治方熏洗治疗58例对照，观察对溃疡面组织中Acvr1及Shox2表达的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2017年1月至2020年1月中国中医科学院广安门医院南区外科糖尿病足溃疡住院患者116例，男67例，女49例，年龄48～75岁，按照随机数字表法分为联合组和对照组，每组58例。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

表1 2组一般资料比较

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 西医诊断：参照《中国糖尿病足防治指南(2019版)》[10]。中医诊断：依据《糖尿病足中医诊疗标准》[11]辨证为瘀毒阻络，热毒炽盛证，证见患足肌肤红肿溃烂，深达筋骨，色黯不鲜，变黑坏死，脓腐，皮肤灼热肿痛，或分泌黄稠脓液，小便黄赤，大便干结，或伴有高热烦渴，舌绛红或黯红，苔薄黄腻或黄，脉细数或洪数。

1.2.2 纳入标准 符合西医诊断及中医辨证标准；均为单侧患病；年龄<75岁,>18岁；Wagner分级Ⅱ～Ⅳ级[10]；患者临床资料完整；无危及健康的其他疾病；入组前1个月未采用其他影响本研究结果的治疗方式；患者及家属知情同意，签署知情同意书；研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2.3 排除标准 合并严重心、脑、肝、肾、胃肠疾病及肿瘤者；严重感染或严重坏死需截肢者；严重营养不良、中度及以上贫血者；存在认知功能障碍或有精神疾病者。

1.3 治疗方法 2组均常规予改善微循环、营养神经、降糖调脂及抗感染等基础治疗，用碘伏消毒、清洁创面，无菌干洁敷料包扎。

1.3.1 对照组 予中药外治方熏洗。药物组成：苦参10 g，红花10 g，木鳖子10 g，黄连10 g，黄柏30 g，乳香15 g，没药15 g。水煎取汁1200 mL趁热熏足，待药液温度降至40 ℃后浸足15～20 min，晾干，敷以无菌干纱布。

1.3.2 联合组 在对照组治疗基础上加祛瘀通络解毒方。药物组成：野菊花、车前子15 g，赤芍、蒲公英、当归各20 g，川芎10 g，玄参15 g，葛根30 g，制乳香、制没药各10 g，川牛膝15 g，生黄芪60 g，三七粉(冲服)、水蛭粉(冲服)各2 g。若有较多的腐烂组织且有臭味，加虎杖15 g、土茯苓30 g解毒除秽；脓液排出不畅，予清创祛腐，加皂刺10 g、花粉30 g、白芷10 g透脓外出；伴有高热、口干、大便秘结者，加生石膏30 g、大黄10 g泻热通便。每日1剂，水煎取汁400 mL，分早、晚2次温服。

1.3.3 疗程 2组均治疗4周。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 溃疡面组织Acvr1、Shox2表达 分别于治疗前及治疗第7、14天同一个位置取直径约3.0 mm的创缘组织，采用免疫组化法[试剂盒购自基因科技(上海)股份有限公司]检测Acvr1、Shox2阳性表达情况。相应组织切片脱蜡复水后，采用柠檬酸盐抗原修复法热修复后冷却至室温，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗；封闭液室温封闭15 min，滴加Acvr1、Shox2一抗(稀释比例1∶500)，室温孵育1 h，PBS清洗；二抗室温孵育1 h，PBS清洗；二氨基联苯胺法(DAB)染色，苏木素复染核2 min，自来水返蓝，梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜观察细胞核呈蓝色，阳性表达部位呈棕黄色。使用Image ProPlus软件对染色结果进行半定量分析，计算平均光密度值(累积光密度值/测量的染色区域面积)，数值越大表示蛋白表达量越高。

1.4.2 血清Acvr1、Shox2水平及蛋白表达 分别于治疗前及治疗第7、14、28天取2组患者外周肘静脉血2 mL，离心后取上清，采用酶联免疫吸附法(试剂盒购自武汉赛培生物科技有限公司)检测血清Acvr1、Shox2水平。另取外周肘静脉血5 mL，采用Western blot法[试剂盒由欧蒙医学诊断(中国)有限公司提供]检测Acvrl和Shox2蛋白表达。血液样本离心后取上清，提取血清蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，后转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，滴加一抗、二抗，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，使用Image J图像处理软件对蛋白条带灰度值进行分析。

1.4.3 中医证候积分[12]比较2组治疗前及治疗第7、14、28天中医证候评分。其中创面深度、面积、肉芽生长情况、分泌物情况、创面周围红肿情况按照无、轻、中、重度分别记0、2、4、6分，烦渴、疼痛按严重程度分别记0、1、2、3分，小便黄、大便干、创面周围灼热根据有无分别记1、0分。分数越高，症状越严重。

1.4.4 疼痛 比较2组治疗前及治疗第7、14、28天疼痛视觉模拟评分(VAS)变化。评分范围为0～10分，分数越高，表示疼痛越剧烈[13]。

1.4.5 临床预后指标 比较2组治疗前及治疗第7、14、28天溃疡面积(溃疡长度×宽度)，统计比较2组肉芽组织形成时间、创面愈合时间及住院时间。

1.5 疗效标准 参考《糖尿病足病中医病证结合诊疗指南》[14]及《中药新药临床研究指导原则：第3辑》[15]拟定。临床痊愈：创面完全愈合，临床症状消失，中医证候积分较治疗前减少≥90%；显效：创面缩小≥75%，<90%，临床症状明显改善，较多新鲜肉芽出现，且无明显脓性渗出液，中医证候积分较治疗前减少≥70%，<90%；好转：创面缩小≥25%，<75%，新鲜肉芽可见，较少渗出液，中医证候积分较治疗前减少≥30%，<70%；无效：创面缩小<25%，临床症状未见好转，或创面出现扩大、截肢，中医证候积分较治疗前减少<30%。有效=临床痊愈+显效+好转。

2 结果

2.1 2组临床疗效比较 联合组总有效率96.55%(56/58)，对照组总有效率77.59%(45/58)，2组总有效率比较差异有统计学意义(P<0.05)，联合组临床疗效优于对照组。见表2。

表2 2组临床疗效比较 例(%)

2.2 2组溃疡面Acvr1、Shox2平均光密度值比较 免疫组化结果显示，随着治疗时间的延长，2组溃疡面Acvr1、Shox2平均光密度值逐渐升高，组内治疗前及治疗第7、14天3个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14天联合组溃疡面Acvr1、Shox2平均光密度值均高于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图1。

表3 2组溃疡面Acvr1、Shox2平均光密度值比较

图1 2组溃疡面Acvr1、Shox2免疫组化图(×200)

2.3 2组血清Acvr1、Shox2水平比较 随着治疗时间的延长，2组血清Acvr1、Shox2水平逐渐升高，组内治疗前及治疗第7、14 、28天4个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14、28天联合组血清Acvr1、Shox2水平均高于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 2组血清Acvr1、Shox2水平比较

2.4 2组血清Acvr1、Shox2蛋白表达比较 随着治疗时间的延长，2组血清Acvr1、Shox蛋白表达逐渐升高，组内治疗前及治疗第7、14 、28天4个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14 、28天联合组血清Acvr1、Shox2蛋白表达均高于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5，图2。

表5 2组血清Acvr1、Shox2蛋白表达比较

图2 2组血清Acvr1、Shox2蛋白表达

2.5 2组中医证候积分比较 随着治疗时间的延长，2组中医证候积分逐渐降低，组内治疗前及治疗第7、14、28天4个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14、28天联合组中医证候积分均低于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 2组中医证候积分比较 分，

2.6 2组疼痛VAS比较 随着治疗时间的延长，2组疼痛VAS逐渐降低，组内治疗前及治疗第7、14 、28天4个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14 、28天联合组疼痛VAS均低于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表7。

表7 2组疼痛VAS比较 分，

2.7 2组溃疡面面积比较 随着治疗时间的延长，2组溃疡面面积逐渐缩小，组内治疗前及治疗第7、14、28天4个时间点两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组间比较显示，治疗第7、14 、28天联合组溃疡面面积均低于对照组同期，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表8。

表8 2组溃疡面面积比较

2.8 2组肉芽组织形成时间、创面愈合时间及住院时间比较 联合组肉芽组织形成时间、创面愈合时间及住院时间均少于对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表9。

表9 2组肉芽组织形成时间、创面愈合时间及住院时间比较

2.9 血清Acvr1、Shox2水平与其他临床指标相关性分析 Pearson分析显示，血清Acvr1、Shox2水平与糖尿病病程、糖尿病足病程、中医证候积分、疼痛VAS、溃疡面面积、肉芽组织形成时间、溃疡创面愈合时间及住院时间呈显著负相关(P<0.05)，Acvr1与Shox2呈显著正相关(P<0.05)。见表10。

表10 血清Acvr1、Shox2水平与其他临床指标相关性分析

3 讨论

足部溃疡是糖尿病患者常见的严重并发症，临床愈合率低，复发率高，若局部感染较重，则可能导致截肢，给患者及其家庭带来了沉重的负担[16]。血管病变、神经病变和感染等导致的创面修复途径受损是糖尿病足溃疡愈合困难的主要原因，加之多种细胞因子紊乱等多因素的影响，常规的抗感染、营养神经及改善微循环等治疗方法往往难以取得良好的治疗效果。自2005年，我国一系列糖尿病足防治指南中都重点推介中医药参与到糖尿病足的治疗过程[17]。

糖尿病足溃疡属中医学“脱疽”范畴，为本虚标实、虚实夹杂之证。发病机制为消渴久病，耗伤气阴，阴虚燥热，热灼津血，变生瘀血、痰浊，阻滞经络，气血津液运行输布失常，肢端肌肤失养而发溃疡；阴虚血热，蕴久化毒，又因外伤毒邪入侵，热毒瘀互结，腐蚀肌肤，久而破溃流脓。瘀血阻络，热毒留滞是糖尿病足溃疡的基本病机[18]，诊断时应以局部辨证为主，兼顾全身辨证，治宜清热凉血，化瘀解毒，通络止痛[19-20]。本研究所用中药外治方中黄连、苦参、黄柏清热解毒；木鳖子清热散结，攻毒疗疮；红花活血祛瘀；乳香、没药活血消肿，生肌敛疮。现代药理研究证实，黄连具有体外镇痛、抗炎、抗菌作用，黄连多糖具有抗氧化、降血糖、减轻炎性反应和神经保护作用[21-22]；苦参含大量生物碱和黄酮类化合物,具有抗菌、消炎、镇痛等作用[23]；红花除能抗炎、镇痛外，还能调节血流动力学，从而促进局部缺血组织微循环和受损神经组织的功能恢复,加速创面愈合[24]；没药水提取物能显著促进人成纤维细胞增殖和Ⅲ型胶原mRNA表达，进而促进创面愈合[25]。祛瘀通络解毒方方中车前子利水消肿，清热解毒；蒲公英、野菊花清热解毒；当归活血化瘀；川芎活血行气，祛风止痛；玄参清热凉血，滋阴泻火解毒；葛根生津退热，解毒疗疮；制乳香、制没药活血消肿，生肌敛疮；水蛭破血逐瘀，活血通经；三七粉凉血消肿，止痹痛，活血散瘀；生黄芪重用补气升阳，敛疮生肌，托毒排脓；川牛膝活血逐瘀，引药下行。诸药合用，共奏清热解毒、祛瘀通络、滋阴升阳、行气活血之功。本研究结果显示，治疗后联合组总有效率高于对照组(P<0.05)；治疗第7、14、28天，联合组中医证候积分、疼痛VAS均低于对照组(P<0.05)，溃疡面面积小于对照组(P<0.05)，肉芽形成时间、溃疡创面愈合时间及住院时间均少于对照组(P<0.05)。表明祛瘀通络解毒方联合中药外治方熏洗治疗可有效提高糖尿病足溃疡的临床疗效，减轻患者疼痛，促进肉芽组织生成，加速创面愈合。

由于糖尿病足溃疡的复发率高，且伴有感染和截肢的风险，因此针对糖尿病足疾病，目前的重点除了有效治疗外，还需要预防复发，确定糖尿病足溃疡复发的预测因子尤为重要。Acvr1在软骨发育和真皮细胞发育中有重要作用，而真皮中主要为成纤维细胞，主要参与皮肤创面肉芽组织的形成。而Acvr1可通过参与机体免疫反应，降低炎症，改善机体内环境，从而激活局部和全身的修复细胞增殖、迁移和分化，从而使大量的成纤维细胞聚集于创面而形成新肉芽，进而加快创面愈合[26]。而糖尿病足患者存在不同程度的感染，因长期慢性炎症使机体免疫功能下降，同时会伴有Acvr1表达降低[27]。Shox2在人皮肤成纤维细胞中保持了胚胎发育过程中建立的HOX基因表达模式的关键特征，其在胚胎、胎儿和成人皮肤组织中均有表达，在高血糖环境下呈低表达水平[28]。而当其水平降低或发生突变时容易发生四肢皮肤发育缺陷等疾病，另外，当皮肤发生溃疡时，伴有炎症水平的升高和Shox2水平降低[29]。本研究通过免疫组化检测发现，治疗第7、14天2组溃疡面组织Acvr1、Shox2蛋白表达量较治疗前显著升高(P<0.05)，且随着治疗时间的延长，其表达量也随之增加(P<0.05)，且联合组较对照组更高(P<0.05)。这与本研究中用酶联免疫吸附法检测各组血清Acvr1、Shox2水平及Western blot法检测血清Acvr1、Shox2蛋白表达的结果具有一致性。进一步的相关性分析显示，血清Acvr1、Shox1水平与糖尿病病程、糖尿病足病程、中医证候积分、疼痛VAS、溃疡面面积、肉芽组织形成时间、溃疡创面愈合时间及住院时间呈显著负相关性(P<0.05)。提示Acvr1及Shox2可能参与了糖尿病足溃疡的发生发展，且高水平的Acvr1及Shox2有助于促进溃疡愈合，这与目前关于糖尿病足的病因可能为骨、关节、血管异常病变及神经病变等具有一致性。Acvr1、Shox2有希望成为糖尿病足溃疡预防和治疗的重要标记物。

综上所述，祛瘀通络解毒方联合中药外治法熏洗治疗糖尿病足溃疡疗效显著，可有效减轻患者临床症状，缩短创面愈合时间，提高Acvr1、Shox2水平或蛋白表达，Acvr1和Shox2有希望成为糖尿病足新的治疗靶点。但本研究也存在不足，如病例数较少，分析Acvr1、Shox2变化时未设立健康人群及非糖尿病人群作对照，研究结果具有一定的局限性，有待在后续的研究中总结完善。