基于网络药理学及分子对接研究消风散治疗过敏性结膜炎的作用机制※

董照阳 陈 茜 魏 伟

(1.江苏省南京市江宁中医院眼科，江苏 南京 210000；2.南京中医药大学第一临床医学院2019级博士研究生，江苏 南京 210000；3.南京中医药大学第一临床医学院眼科教研室，江苏 南京 210000)

近年来，随着大气污染的加重及眼部卫生因素等影响，过敏性结膜炎(allergic conjunctivitis，AC)的发病率逐年增长，患病率高达30%[1-2]。AC是结膜对变应原刺激产生超敏反应所引起的一类常见眼科疾病，主要与免疫球蛋白E(IgE)水平异常所致的Ⅰ型变态反应和部分T淋巴细胞介导的Ⅳ型变态反应有关。AC发病机制复杂，至今尚未阐明，其主要发病机制为变应原与眼部组织接触，并与特异性抗原IgE结合,导致肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放前列腺素、组胺、白三烯等因子。AC常见症状为眼痒和异物感，并伴有结膜充血、水肿、滤泡等表现。轻度结膜炎会影响人们的生活和工作，重度结膜炎可造成不可逆转的眼损伤，已引起眼科医生的广泛重视。目前，AC西医治疗以滴眼药水为主，主要有抗组胺药、肥大细胞稳定剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、血管收缩剂、非甾体抗炎药等。但其疗程往往较长，治疗后可减轻结膜组织的变态反应，但用药一段时间后病情易反复，且存在较多副作用[3-4]。

中医古籍《诸病源候论·目病诸候》《审视瑶函》和《太平圣惠方》等对AC均有记载，该病多由风热时邪侵犯肺卫肌表，上壅胞睑、白睛，阻滞脉络，气血不畅而发病。故在AC的诊治过程中应从整体观念出发，全面认识AC的发病因素。中医药治疗AC疗效确切且安全性高，为防治AC复发和加重积累了丰富诊治经验。相关研究表明，中药可通过多通路和多靶点发挥治疗AC作用，也可与糖皮质激素联用，减少糖皮质激素的不良反应，在临床应用上具有巨大优势[5]。中药治疗以清热利湿、通络止痛、解毒凉血类为主。消风散出自明·陈实功《外科正宗》，由荆芥、防风、牛蒡子、蝉蜕、当归、生地黄、石膏、知母、苦参、苍术、胡麻仁、甘草、木通组成，具有疏风养血、清热除湿之功效。该方在临床上广泛应用于荨麻疹、湿疹、皮肤瘙痒等皮肤病领域[6-8]。我们在临床上依据养血、疏风、清热和祛湿四法，使用消风散治疗AC，治疗后结膜充血、眼痒和异物感等诸症减轻。目前对消风散治疗AC的临床和实验研究较少，给中药的有效应用带来了局限。

网络药理学(network pharmacology)通过融合系统生物学和药理学揭示了中药在人体调节网络中的作用。网络药理学通过研究中药、疾病、靶点与通路之间的复杂关系，进一步阐明中药作用机制、药效物质基础，对新药研发具有重要的意义。因此，本研究利用网络药理学相关数据库联合分子对接方法，构建“多成分-多靶点-多途径” 之间的复杂网络，系统地研究消风散治疗AC的成分、作用靶点及调控通路的信息，为以后的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 消风散化学成分和作用靶点筛选 通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)(http：//tcmspw.com)检索消风散的化学成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和类药性(DL) ≥0.18为药物筛选的关键参数，记录最终得到符合条件的化学成分。并利用此平台搜索有效成分的蛋白作用靶点，应用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)检索上述靶点名称，确认人源靶点，得到靶标蛋白所对应的基因名。

1.2 AC相关靶点基因获取 通过对人类基因数据库(Geen Cards)(https://www.genecards.org)、疾病相关的基因与突变位点数据库(Dis Ge NET) v 5.0(http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)和疗效药靶标数据库(TTD)4.3.02(https://db.idrblab.org/ttd)，以“allergic conjunctivitis”为关键词进行检索，得到AC的相关靶点基因。

1.3 化合物-疾病靶点网络构建及可视化分析 将获得的消风散相关靶点与AC靶点基因进行Venn 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)作图分析，获得二者交集靶点。然后借助Cytoscape 3.7.2软件(http://www.cytoscape.org/)进行“化合物-疾病靶点”网络图构建，根据化合物与靶点连接情况，筛选消风散的主要化合物。

1.4 交集靶点蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选 利用STRING在线数据库对交集靶点的PPI进行分析，将交集靶点信息导入STRING数据库，选择“multiple proteins”模式，物种选择“Homo sapiens”，最低相互作用评分设置为0.9作为筛选条件，从而得到靶点的PPI信息。保存tsv格式文件，导入至Cytoscape 3.7.2软件中，获得PPI，将网络结果可视化，根据中心度值(BC)、亲中心度(CC)和等级值(DC)筛选关键作用靶点。

1.5 基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 为了进一步了解上述靶标蛋白基因的功能以及在信号通路中的作用，将筛选得到的交集靶点导入DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov)，基因列表对应的物种为“Homo Sapiens”，进行GO功能和KEGG通路富集分析。以P<0.05进行靶基因筛选，进一步说明消风散的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用，并应用Graph Pad Prism 7软件和Omishare(http://www.omicshare.com/tools/index.php)制作柱状图和气泡图，对结果进行可视化分析。

1.6 分子对接验证 首先，根据PPI筛选出关键靶点，利用蛋白质结构数据库(PDB)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载核心靶点的蛋白结构，然后使用Pymol去除水分子和结合的配体，保存为pdb格式。然后，利用Swiss Dock在线对接分析对接服务器获得对接评分，以评价消风散关键活性成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 消风散的活性成分及作用靶点筛选结果 本研究通过用TCMSP数据库对消风散方中中药进行活性成分检索，OB和DL筛选并删除重复项后，共得到183个活性化合物。同时，在TCMSP 数据库Related Targets中得到化合物的相关靶点，由UniProt统一命名后，排除未找到的人的基因，共涉及231个基因Symbol。

2.2 AC相关靶点基因的筛选 通过Geen Cards数据库得到AC相关靶点1639个，通过筛选设置relevance score>5，最终获得363个相关靶点；Dis Ge NET数据库得到与AC相关靶点20个；TTD数据库得到与AC相关靶点4个。删除重复靶点16个，获得疾病相关靶点371个。

2.3 “化合物-疾病靶点”的网络构建及可视化分析 利用Venn 2.1软件将消风散的活性化合物对应的231个药物靶点与AC对应的371个靶点基因取交集，获得“活性化合物-AC”共同靶点基因49个，见图1。将49个共同靶点通过Cytoscape 3.7.2软件构建消风散“化合物-共同靶点-疾病”相互作用网络图，提取消风散“化合物-疾病靶点”的核心网络，见图2。从图2可看出同一活性成分可作用于不同靶点基因，不同活性成分也可作用于同一靶点基因。其中，连接度较高的化合物有Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitosterol、Stigmasterol、5-O-Methylvisamminol等(见表1)，这些化合物可能是消风散治疗AC的关键活性成分。

图1 消风散活性化合物靶点与AC疾病靶点关系Venn图

表1 消风散治疗AC的关键活性成分

紫色椭圆形代表AC相关靶点基因，绿色长方形代表有效成分化合物，灰色线条代表相互作用关系

2.4 PPI网络图构建与分析 将49交集靶点导入STRING中，保存其tsv格式文件。将获取tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络拓扑学分析后，得到消风散对AC作用PPI网络图。网络中含有45个节点，159条相互作用关系。利用Cytoscape 3.7.2的CytoNCA插件对以上结果进行拓扑学参数分析和筛选。如图3所示，经过2次筛选，BC、CC和DC均大于中位数的靶点分别为信号转导和转录激活因子3(STAT3)、白细胞介素6(IL-6)、JUN、白细胞介素4(IL-4)、血管内皮生长因子A(VEGFA)和丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)。

图3 消风散治疗AC相关靶点的PPI网络及其关键靶点网络

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 DAVID中GO功能富集分析以P<0.05为阈值得到79个条目。其中，生物过程(BP)条目62个，细胞组成(CC)条目7个，分子功能(MF)条目10个。取排名前10的条目，通过Graph Pad Prism 7软件将这些条目做成可视化条形图。消风散治疗AC涉及细胞因子活性、血红素结合、生长因子活性、过氧化物酶活性、趋化因子活性和前列腺素内过氧化物合酶活性等MF；与细胞对脂多糖的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、免疫反应、内皮细胞凋亡过程的负调控、炎性反应、调节血压、T淋巴细胞增殖的正调控和凋亡过程的负调控等BP相关；与细胞外间隙、质膜外侧、细胞外基质、胞外外泌体等CC相关。见图4。

图4 消风散治疗AC的GO功能富集分析图

对消风散作用于AC的主要靶点进行KEGG通路富集分析，以P<0.05为阈值筛选得到55条信号通路，主要涉及肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、T淋巴细胞受体(T cell receptor)信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、类风湿关节炎和炎症性肠病(IBD)信号通路等。通过Omicshare软件对其进行可视化分析，气泡图见图5。

注：圆点越大，富集基因数目越多；P值越小，圆点颜色越黑

2.5 关键靶点的分子对接 选择关键靶点STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14与对应的核心活性成分Quercetin进行分子对接，以直观的方式展示Quercetin的最佳构型和关键靶点之间的相互作用。分子对接结果如图6所示，Quercetin与关键靶点蛋白有较好的结合活性，并且分子构象结合稳定。如表2所示，蛋白质与小分子结合越紧密，Full Fitness值越低。进一步证明了消风散可能是通过调节以上相关靶点发挥治疗AC的作用。

表2 Quercetin与关键靶点的分子对接结果

图6 Quercetin与关键靶点分子对接图

3 讨论

AC是由于变应原引起了广泛的抗原特异性辅助性T淋巴细胞(Th)反应使眼部结膜组织发生的变态反应。Th依据其生成的细胞因子分为Th1、Th2、Th17和调节性T淋巴细胞。Th1细胞产生IL-2、干扰素γ(IFN-γ)、TNF-α，Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，抗原特异性Th2细胞产生IL-4、IL-5等细胞因子。细胞因子参与IgE的产生及嗜酸性粒细胞的激活，促进黏液的分泌，从而在AC的发病中起关键作用[9]。因此，抑制结膜对变应原反应的Th1-Th2反应转化是治疗AC的关键[10]。Th17细胞参与一系列炎性反应，其主要通过分泌的细胞因子IL-17来发挥作用[11]。Th17和调节性T淋巴细胞之间的平衡具有体外抗炎作用[12]。

中药复方是中医临床用药的主要手段，按照中药配伍规律，以达到协同增效、扶正祛邪的目的。AC属中医学“目痒”“时复症”“痒若虫行症”等范畴。《太平圣惠方·治目痒急诸方》曰: “夫目痒急者，是风气客于睑眦之间，与血气津液相搏，使眦痒而泪出。”中医学认为，AC因风邪侵袭，经络受阻，或脾胃湿热内蕴，外感风邪，风湿热相搏，上壅于目所致[13]。常规治疗以祛风除湿、健脾清肺或清利湿热为主。消风散中荆芥、防风相须为用，以达腠理、发汗散邪之效，牛蒡子、蝉蜕疏风止痒，共为君药；苍术散风除湿，木通、苦参清热燥湿，石膏、知母清热泻火，共为臣药；佐以当归、生地黄、黑芝麻养血活血；甘草清热解毒，调和诸药，为使药。诸药合用，共奏疏风养血、清热除湿之功。

本研究结果显示，消风散包含23个有效化合物，其中Degree值较高化合物主要包含黄酮类成分、色原酮类成分和植物甾醇类成分。Quercetin作为存在于荆芥和苦参中的黄酮醇类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、免疫调节等多种药理学作用[14]。大量研究表明，Quercetin能增强视网膜色素上皮细胞中抗氧化酶的活性[15]，减少炎症相关因子IL-6、IL-8等的表达[16]，抑制视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤。相关研究表明，Quercetin可以调节炎性和免疫反应来减轻眼部的炎性反应，其作用机制可能是通过稳定肥大细胞、诱导Th1细胞增加IFN-γ表达、抑制Th2细胞分泌IL-4、阻断IL-6分泌和传导[17-18]。Wogonin是防风和苍术中一种重要的黄酮类化合物，具有明显的抗炎和抗氧化作用[19]。张海丽等[20]研究发现，Wogonin可能通过减少巨噬细胞活性氧的产生，降低核转录因子κB(NF-κB)调控炎症相关因子(IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α)的基因转录，进一步抑制巨噬细胞的炎性反应。5-O-Methylvisamminol是防风中主要的色原酮类化合物，具有抗炎、退热、镇痛、镇静等作用[21]。Sun等[22]研究发现5-O-Methylvisamminol可通过NF-κB/IκB-α信号通路发挥抗炎作用，改善氧化应激，抑制脂多糖(LPS)刺激的BV-2小胶质细胞过度活化，改善LPS诱导的小鼠抑郁。β-sitosterol是防风、荆芥、当归和牛蒡子中主要的植物甾醇类化合物，具有抗炎、抑制肿瘤、免疫调节、抗氧化、镇痛、促进伤口愈合等广泛的药理活性[23]。Zhang F等[24]研究发现β-sitosterol可以促进核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的表达，抑制NF-κB、NF-κB受体活化因子配体(RANKL)和STAT3的表达，发挥抗关节炎作用。Luteolin是荆芥和苦参中的一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和神经保护等药理作用[25]。张淑荣等[26]研究表明，Luteolin可通过抑制Toll样受体4/髓样分化因子88(TLR4/MyD88)信号通路相关蛋白及其下游炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-12)表达，进而有效抑制角膜炎性反应，对烟曲霉菌性角膜炎大鼠具有治疗作用。因此，消风散中主要活性成分Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitostero、Stigmasterol和5-O-Methylvisamminol等在治疗AC中发挥重要作用。

多种细胞因子都参与了AC的发病机制，如白细胞介素、IFN、趋化因子、TNF等[27]。本研究首先基于网络药理学数据库初步筛选，消风散治疗AC作用靶点49个，并依据PPI网络分析筛选出6个关键靶点。PPI结果显示抗AC的关键靶点为STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14。结果显示，消风散可能通过多靶点协同发挥治疗AC的作用。STAT3信号通路是IL-6发挥促炎性反应和促肿瘤血管新生的主要通路[28]。Guo等[29]研究显示，通过增强miR-19b可以抑制AC小鼠模型STAT3的表达，进而减轻眼表的炎性反应。IL-6是一种多效细胞因子，在调节免疫反应和炎性反应中发挥重要作用[30]。AC眼中IL-6表达升高，促进B细胞增殖分化和分泌抗体，正向调节IgE的生成与活性[31]。在疾病早期，肥大细胞分泌的IL-4和IL-13可激活结膜纤维母细胞，促使其分泌嗜酸性粒细胞趋化因子、胸腺和激活相关的趋化因子。c-Jun氨基末端激酶(JNK)在转导细胞外信号和炎性反应等方面发挥重要的作用。MAPK14是MAPK家族中的重要成员之一，其表达异常可致免疫功能失调和炎性反应。活化的MAPK14激活p38MAPK通路，p38MAPKs在由促炎细胞因子或外界刺激所引发的细胞级联反应中发挥重要作用[32]。

为了进一步说明靶蛋白在基因功能和信号通路中的作用，本研究进行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。GO功能富集结果显示，消风散治疗AC涉及细胞因子活性、血红素结合、生长因子活性、过氧化物酶活性、趋化因子活性和前列腺素内过氧化物合酶活性等多种物质；与细胞对脂多糖的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调节、免疫反应、内皮细胞凋亡过程的负调控、炎性反应、调节血压、T淋巴细胞增殖的正调控和凋亡过程的负调控等生物过程相关；与细胞外间隙、质膜外侧、细胞外基质和胞外外泌体等细胞组成相关。由KEGG通路富集分析可知，消风散治疗AC主要通路有TNF信号通路、T淋巴细胞受体信号通路、HIF-1信号通路、类风湿关节炎和IBD通路等。活化的肥大细胞可以产生和分泌促炎症介质TNF，在眼表免疫调节中起重要作用，加重了AC症状[33]。TNF-α可激活MAPK信号通路，MAPK信号通路在各种眼表疾病中起到介导炎症和调控细胞凋亡的作用[33]。研究表明，T淋巴细胞所参与的免疫应答是机体整个免疫调节的核心，T淋巴细胞受体及其他相关的体液因子在T淋巴细胞活化与抗原识别中起重要作用[34]。HIF-1α的表达影响炎症发生及消退，还影响免疫细胞的募集、迁移、吞噬和杀伤等功能[35]。炎症部位的多种免疫细胞中HIF-1α表达升高，HIF-1α表达增高促进Th1和Th17的表达，最终诱导IFN-γ和IL-17的产生[36]。总之，消风散治疗AC与上述通路密切相关，这表明消风散的有效成分可能通过作用于这些信号通路以达到治疗AC目的。

分子对接结果表明，Quercetin与STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14对接结合能分别为-2 924.87、-1 201.35、-3 094.74、-912.55、-2 432.12和-1 818.79 kcal/mol，这提示筛选得到的核心活性成分与靶点之间有较强的结合活性，同时也进一步证明网络药理学预测药物成分与疾病靶点的可靠性，以此发挥治疗AC的作用。

本研究采用网络药理学方法和分子对接相结合的方法，对消风散及AC的靶点进行预测，构建“化合物-靶点-信号通路”网络及PPI分析，初步阐明了消风散治疗AC的作用机制。总之，消风散治疗AC的主要活性成分可能为Quercetin、Luteolin、Wogonin、β-sitosterol、Stigmasterol和5-O-Methylvisamminol等，这些活性成分通过作用于STAT3、IL-6、JUN、IL-4、VEGFA和MAPK14等靶点和TNF信号通路、T淋巴细胞受体信号通路、HIF-1信号通路等发挥对AC的干预作用。这也证实了消风散是通过多靶点、多方面发挥干预AC的作用，为后续分子生物学实验和机制的进一步探讨及临床应用等提供了重要的理论依据。