EasyDisc与传统平皿计数法检测水中菌落总数的比较

周东海，赵旭坤，王晋宇，郭志宇，杨烨

（1.苏州苏水环境监测服务有限公司，江苏苏州 215131；2.爱德士缅因生物制品贸易（上海）有限公司，上海 200336）

近些年，人们对生活品质的追求越来越高，生活饮用水品质提升的呼声不断，上海和深圳分别发布了地方《生活饮用水水质标准》（DB31/T 1091—2018）和（DB4403/T 60—2020），其产品指标的数目和要求与2006年原卫生部发布的《生活饮用水卫生标准》（GB 5749—2006）均有一定的提升，其中表征水体微生物污染程度的菌落总数限值均由100 CFU/mL调整为50 CFU/mL。目前测定水中菌落总数的标准方法主要为传统的平皿计数法，即用营养琼脂培养基在36～37 ℃有氧静置培养48 h然后计数，由于该方法的培养条件限制，部分已被证实存在于水体中的有害细菌，如弧菌（Vibrio）、沙门氏菌（Salmonella）等，难以在此条件下生长，导致检测值偏低[1-2]。同时该方法存在诸如培养基配制、灭菌等步骤多，操作过程易引入污染，对检测环境要求高，结果读数耗时且人工读数误差大等不足，不能满足实验室大宗样品的快速检测和突发应急检测的需求，虽然该方法在近期有一定更新，但是其原理和操作步骤并没有显著变化[3]。水中菌落总数检测的酶底物法（EPA9215），已于2013年写入广东省地方标准《水中菌落总数复合酶底物检测方法》（DB44/T 1163—2013），同时该方法已经在《生活饮用水标准检验方法》（GB/T 5750）征求意见稿中进行了公示，可以认为是相对成熟的方法。其他菌落总数检测方法如定量盘检测法（HPC for Quanti-tray）[4]或者ATP检测法[5]，存在样品取样量大或耗材不易保存等缺点，均未得到大面积推广。

EasyDisc法是一种检测水中菌落总数的新方法，基本原理是EasyDisc内置了添加显色底物的脱水PCA培养基，微生物在此培养基上能代谢生成特异性酶，促进显色底物反应生成蓝色物质，方便计数[6]。操作时仅需要将1 mL样品加入EasyDisc平皿，水平摇晃使样品均匀分布，室温下静置后放入36 ℃培养箱培养。与传统平皿计数法相比，该法无需烦琐的人工配制培养基环节，操作时间短，显著降低检测流程可能引入的污染。本文使用EasyDisc法和传统平皿计数法，同时检测NSI质控样和苏州地区供水生产和供水管网样品中的菌落总数，并将检测结果进行了比较和分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

平板计数琼脂（PCA）、营养肉汤培养基（NB），北京陆桥技术股份有限公司；定性标准菌株大肠埃希氏菌和肠球菌，中国工业微生物菌种保藏中心；硫代硫酸钠，国产分析纯，配制0.1 mol/L溶液，高压蒸汽灭菌备用；EasyDisc试剂、NSI质控样、无菌磷酸缓冲液，美国IDEXX公司；水样品，苏州地区X水厂水源水和出厂水，X水厂对应供水管网的末梢水和二次供水；样品采集和保存参照《生活饮用水标准检验方法 水样的采集和保存》（GB/T 5750.2—2006）进行；上海森信GRP-9050隔水式恒温培养箱，控温精度达到0.5 ℃，经权威计量测试机构计量合格。

1.2 实验方法

1.2.1 平皿计数法

参照标准方法《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》（GB/T 5750.12—2006）（1.1）进行检测，将方法中的营养琼脂培养基（NA）替换成平板计数琼脂（PCA）。

1.2.2 EasyDisc法

取下EasyDisc盖子，向平皿中加入1 mL样品，轻轻回旋平皿，使样品均匀遍布于整个平皿，室温静置20 min后放入36 ℃培养箱中培养（48±3）h。

1.2.3 NSI质控样使用方法

将质控样从冷藏箱中取出，室温平衡15 min后全部移入100 mL无菌磷酸缓冲液中，溶解后30 min内使用。

1.2.4 其他定性标准菌株使用方法

按照说明书复壮后，接入营养肉汤（NB），振荡培养24 h得到菌悬液，使用无菌磷酸缓冲液梯度稀释103、104倍，获得不同浓度的菌悬液备用。

2 结果与分析

2.1 NSI质控样检测结果分析

按照1.2.3方法的准备质控样，按照1.2.1和1.2.2分别采用两种方法对其进行检测，检测结果见表1和图1，可以发现平皿计数法和EasyDisc法检测NSI质控样，其结果均在其可接受范围内。

表1 EasyDisc和平皿计数法检测NSI质控样的结果

图1 EasyDisc和平皿计数法检测图片

2.2 实际样品检测结果分析

选取苏州地区40个实际样品，采用2种方法进行检测，结果见表2。传统平皿计数法和EasyDisc法具有相近的实验结果，适用于该地区水中菌落总数的检测。

表2 EasyDisc和平皿计数法检测苏州地区实际样品的结果

选取苏州地区1个出厂水样品和1个管网水样品，采用硫代硫酸钠脱氯后，分别加入采用1.2.4方法制备得到的大肠埃希氏菌、肠球菌及两种菌的混合悬液，检测结果如表3所示。

表3 EasyDisc和平皿计数法检测苏州地区出厂水和管网水加标样品的结果

对表2中水源水数据和表3中所有数据进行EasyDisc和平皿计数法检测结果的配对t检验，由于微生物的检测数据结果属于偏态分布，对其以10取对数计算后再进行t检验[7]，结果P=0.058＞0.05，说明2种方法不存在显著性差异，可以认为EasyDisc和平皿计数法的实验结果具有一致性，均可有效检测水中的菌落总数。大肠埃希氏菌和肠球菌可分别代表肠道微生物中的革兰氏阴性和阳性菌，通过实验可以发现采用EasyDisc检测两个菌种加标样品和平皿计数法并无明显差异，并且混合菌种检测并未见显著竞争抑制现象，可以认为EasyDisc在检测水源水和生活饮用水样品中具有一定的普适性。

3 结语

EasyDisc是检测水中菌落总数的新方法，与传统平皿计数法相比，从比对数据结果上看未发现明显差异。EasyDisc法具有操作便捷、结果清晰、环境需求低、读数误差少等明显优点，能够为实验室便捷检测水中菌落总数提供支持，一定程度上提高了检测效率。由于EasyDisc法测定水中菌落总数还未有相关正式检测标准方法，且该法检测成本相对于平皿计数法略高，因此可作为传统平皿计数法的补充方法。同时考虑EasyDisc法操作快速简单，在各类应急突发检测方面也有很大的前景，有望成为水中菌落总数快速便捷检测法的一种。