EasyDisc法与传统平皿计数法检测水中菌落总数的比较

孙 杰

(上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司，上海 200082)

水中菌落总数作为常规微生物检测项目之一，可以及时反映水体受微生物污染的程度。目前，国内检测标准大多以传统平皿计数法作为水中菌落总数的主要检测方法。但随着细菌种类的不断更新，传统平皿计数法并不适用于检测厌氧菌、非嗜中温及对繁殖所需营养有特殊要求的细菌[1]；在试验过程中因操作步骤复杂易引入污染；试验结果判定困难易造成较大的人为误差，对试验技术人员和检测环境要求极高，部分实验室难以达到。因此，不能满足实验室应急样品及大批量样品的检测需求。与传统平皿计数法相比，EasyDisc法具有操作简便、外来污染及人为误差小、无菌环境要求低等优点，且大量试验数据证实EasyDisc法与传统平皿计数法在检测水中菌落总数结果上无明显差异。因此，该方法可以广泛应用于水中菌落总数的检测。相较于2002年美国环保署(EPA)批准使用酶底物法(SimPlate法)检测饮用水以及地表水中的菌落总数，传统的平皿计数法已30余年未更新。2013年广东省中山市供水有限公司最早将SimPlate法写入广东省地方标准(DB44/T 1163—2013)[2]。2019年张颖[3]等采用定量盘法(HPC for quanti-tray)检测水中菌落总数，该方法在原理上与SimPlate法类似，与传统平皿计数法的检测结果相比也没有显著差异，但其检测时需要100 mL样品，且要使用封口机和紫外灯等辅助设备，操作相对繁琐。

EasyDisc法于2021年研发成功，是一种新型的水中菌落总数检测方法，目前在国内外还处于试用阶段。其基本原理是在EasyDisc平皿底部添加有显色底物的脱水PCA培养基，微生物在该培养基上生长代谢时所产生的酶会促进相应显色底物反应生成蓝色物质，便于计数，降低了结果判定的人为误差。与传统平皿计数法相比，该方法无需配制培养基，检测过程简便，每个样品前处理耗时不足1 min，显著降低了外来污染和人为误差，提高了检测结果的准确性及稳定性，适用于应急样品及大批量样品的检测需求。

本文采用传统平皿计数法和新型检测技术EasyDisc法两种检测方法对NSI定量质控样品和上海地区实际水样进行检测，并比较分析两种方法的检测结果[4-5]。

1 试验部分

1.1 试验试剂及设备

EasyDisc平皿、HPC定量质控样品(NSI 200317)、无菌PBS缓冲液、无菌取样瓶等耗材由IDEXX公司提供。营养琼脂培养基购自北京陆桥技术股份有限公司；试验使用国产隔水式恒温培养箱，温控精度为±0.5 ℃，经计量部门校准合格。

1.2 试验步骤

1.2.1 水样采集

管网水水样取自上海某地区的管网监测点，二次供水水样为上海居民的龙头水。参照《生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存》(GB/T 5750.2—2006)，选取一次性无菌采样瓶(含硫代硫酸钠)作为采样容器，并在4 h内对采集水样进行检测[6-8]。

1.2.2 质控样品制备

将NSI定量质控样品从-10 ℃冰箱取出，在室温下平衡10～15 min后，转移至100 mL无菌PBS缓冲液中，水平振荡摇匀，待NSI定量质控样品完全溶解后，30 min内进行检测。

1.2.3 质控稀释样品制备

将质控样品充分混匀后，取10 mL质控样品转移至100 mL无菌取样瓶中，用无菌水稀释至刻度线，配制成稀释10倍的质控稀释样品溶液。

1.2.4 平皿计数法测定水中菌落总数方法

平皿计数法测定水中菌落总数参照《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》(GB/T 5750.12—2006)[8]。

1.2.5 EasyDisc法测定水中菌落总数方法

量取1 mL待测样品加入EasyDisc平皿，充分摇匀，使样品均匀分布于整个平皿，在室温下静置20 min后正置放入(36±1) ℃培养箱中培养(48±3) h后统计分析菌落总数结果。

2 结果分析

2.1 质控样品检测结果分析

分别以平皿计数法和EasyDisc法平行检测同一定量质控样品15次，其检测结果表明两种方法的检测结果均在质控样品结果可接受范围内。为进一步评价两种方法检测结果的准确性，计算检测结果与真值的相对误差，如表1、图1所示。EasyDisc法检测结果与真值的相对误差更小，更接近于真值，准确度更高；计算两种方法相对误差的标准偏差可得SD(平皿计数法)=5.84%，SD(EasyDisc法)=3.66%。综上，EasyDisc法检测结果与真值相对误差的标准偏差更小，表明其与真值的相对误差离散程度较小，性能更加稳定。

2.2 质控稀释样品检测结果分析

为验证两种方法在低浓度样品检测中的准确性和稳定性，分别以平皿计数法和EasyDisc法平行检测同一稀释10倍的定量质控样品15次，其检测结果如表2、图2所示。结果表明：平皿计数法合格率为80%，EasyDisc法合格率为100%；EasyDisc法检测结果与真值的相对误差更小，更接近于真值，准确度更高；两种方法检测结果与真值相对误差的标准偏差为SD(平皿计数法)=14.31%，SD(EasyDisc法)=9.28%。综上，EasyDisc法检测低浓度样品的准确性更高，性能更稳定。

表1 两种方法检测质控样品的结果Tab.1 Detection Results of QC Samples by Both Methods

图1 两种方法检测结果真值的相对误差的标准偏差Fig.1 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Methods

2.3 实际样品检测结果分析

选取上海地区30组管网水样品及50组二次供水样品，分别以平皿计数法和EasyDisc法检测选取的80组实际样品，其检测结果如表3所示。为探究两种方法在实际样品检测中的相关性，根据检测数据绘制折线图，如图3所示。结果表明：两种方法的检测结果趋势基本相同，具有很强的相关性。

表2 两种方法检测质控稀释样品的结果Tab.2 Detection Results of QC Dilution Samples by Both Methods

图2 两种方法检测结果真值的相对误差的标准偏差Fig.2 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Method

为进一步探究两种方法在检测实际样品时是否存在差异性，以及使检测结果呈正态分布，将运用SPSS Statistics软件对平皿计数法和EasyDisc法的检测结果，作对数处理后进行t检验分析，结果如表4所示。平皿计数法与EasyDisc法的泊松相关系数为0.894，属极强相关性；t检验P=0.325(>0.05)，说明两种检测方法的检测结果无显著差异，具有高度一致性。可认为平皿计数法、EasyDisc法均可有效检测水中菌落总数。

表3 两种方法检测实际样品的结果Tab.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

图3 两种方法检测实际样品的结果Fig.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

3 讨论

3.1 质控样品检测

平皿计数法和EasyDisc法对HPC定量质控样品检测结果的真值相对误差绝对值的平均值分别为6.27%和3.02%。EasyDisc法检测HPC定量质控结果的真值相对误差相较于平皿计数法的真值相对误差更小，表明EasyDisc法的检测结果更接近真值，准确度更高。与真值相对误差的标准偏差的计算结果表明，EasyDisc法与真值相对误差的标准偏差更小，其检测结果与真值的相对误差离散程度较小，性能更加稳定。

表4 两种方法对实际样品检测结果的t检验Tab.4 T-Test of Results of Practical Sample by Both Methods

3.2 质控稀释样品检测

平皿计数法和EasyDisc法对稀释10倍的低浓度HPC定量指控样品检测结果的真值相对误差绝对值的平均值分别为11.98%和8.86%；平皿计数法和EasyDisc法的检测合格率分别为80%和100%。EasyDisc法检测HPC稀释10倍的低浓度定量质控结果的真值相对误差相较于平皿计数法的真值相对误差更小、合格率更高，表明在低浓度的情况下EasyDisc法的检测结果准确度仍优于平皿计数法。

3.3 实际样品检测

对管网水和二次供水等实际样品，平皿计数法和EasyDisc法的检测结果泊松相关系数为0.893，属极强相关性，t检验P为0.325(>0.05)，表明两种方法检测数据在统计学意义上无显著差异，均可检测水中菌落总数。

3.4 EasyDisc法优势

EasyDisc法于2021年研发成功，是一种新型的水中菌落总数检测方法，对传统平皿计数法进行了显著革新，相较于传统的90 mm平皿，其47 mm的平皿既能减少废弃物处理的成本又能增加实验室检测量。其PCA培养基已脱水固定于平皿底部，省去传统方法中配置培养基的过程，节省大量时间的同时减少了配置培养基带来的污染。EasyDisc法产品的1年保质期，在优化实验室管理流程的同时，也降低了相应耗材的浪费。在PCA培养基中添加显色底物，与微生物生长代谢所产生的酶相互反应形成蓝色菌落，配合白色底部及网格线更加便于观察，降低人为计数误差。同时，通过大量数据分析水中菌落总数检测干扰菌种，添加杂菌生长抑制剂，使PCA培养基对检测环境要求大幅降低。与传统平皿计数法相比，EasyDisc法测定质控样品及质控稀释样品时，准确度及稳定性均优于传统的平皿计数法；测定实际样品时，其检测结果与平皿计数法无显著差异，但因EasyDisc法无需制备培养基，操作更加简便，对无菌环境及检测人员技术无明显要求等优势，更适用于大批量样品及应急突发样品的检测。

4 结论

(1)平皿计数法测定水中菌落总数，配制培养基操作繁琐，要求严格；使用高温灭菌设备需相应资格证；试验结果读数人为误差大。因此，平皿计数法不能满足实验室应急样品及大批量样品检测的需求。EasyDisc法无需配制培养基，每个样品前处理耗时不足1 min，检测过程简便，显著降低了外来污染和人为误差，且在实际样品检测中可以发现其检测结果与平皿计数法无明显差异。

(2)采用EasyDisc法测定水中菌落总数，具有操作更加简便、人为误差少、计数便捷、对试验技术人员及试验环境要求低等优势，其质控样品与真值相对误差的标准偏差为3.66%，低于平皿计数法的5.84%，质控稀释样品的合格率为100%，高于平皿计数法的80%，表明其检测结果的准确性及稳定性均优于传统的平皿计数法，可以满足实验室对水中菌落总数的检测要求。同时，该方法在应急突发样品现场检测方面也有很大的应用前景。

(3)鉴于EasyDisc法测定水中菌落总数操作简便、结果准确、实验室检测环境要求及采购设备成本低，更适用于中小型实验室在大批量样品及应急突发样品的检测，在未来必将成为一种发展趋势。