4种兼性厌氧微生物农药的芽孢含量检测方法研究

王 双，师丽红，袁善奎，张 燕

(农业农村部农药检定所，北京 100125)

1 引言

有效成分含量是决定微生物农药药效的重要因素，目前,对于产孢微生物农药,一般采用技术成熟度较高的显微计数法和平板菌落计数法进行检测，而产品的前处理方式以及培养方式均对检测结果具有重要影响，不同的检测方式可能会导致检测结果出现较大的误差。平板菌落计数法即将待测样品经适当稀释后，取一定量的稀释液涂布在平板上进行培养，这在一定程度上创造了含氧条件。兼性厌氧菌对氧气有特殊要求，无氧和有氧条件下均能正常生长，但针对不同的兼性厌氧菌，不同供氧条件对该类微生物的含量检测结果的影响研究较少。本研究选用4种兼性厌氧微生物农药[2～5]，在3种不同的培养基上对不同的培养方式进行含量检测结果的研究和比较，找到适宜的微生物农药含量检测方法，为准确评价微生物农药的产品质量提供参考。

2 材料和方法

2.1 供试药剂 供试药剂(表1)，其中包括2种水剂和2种可湿性粉剂。

表1 供试兼性厌氧微生物农药信息

2.2 培养基 对供试药剂分别选用细菌培养常用营养琼脂(NA)培养基、LB固体培养基(表2)进行培养。此外，针对每种生物农药，还选用一种特殊培养基(表3)进行培养效果比较。

表2 培养基成分

*注：NA培养基为商业成品，购自北京金百环商贸有限责任公司。

表3 特殊培养基成分

2.3 培养方法 采取涂平皿法、平皿夹层法、倒平皿法分别对四种兼性厌氧微生物农药进行含量测定。试验前在无菌条件下将药剂稀释到适宜浓度。

涂平皿法是将适宜浓度的稀释液吸取100μL于培养基平板上，用曲玻棒均匀涂布在整个平板表面，放于最适宜培养条件下进行培养。

平皿夹层法参考穆军等分离纯化厌氧细菌的方法。将10mL灭菌培养基倒入平板内，待冷却后，将适宜浓度的稀释液吸取100μL于培养基平板上，用曲玻棒均匀涂布在整个平板表面，涂布完成后将10mL 45℃左右的培养基再次倒入平皿内，培养基凝固后置于适宜的培养条件下进行培养。

倒平皿法是将培养基加热融化并冷却至45℃，放在水浴锅中保温待用。将适宜浓度的稀释液100μL放入无菌培养皿内，培养皿内注入20 mL 45℃培养基，迅速用手摇动，使稀释液与培养基充分混合摊布均匀，静置凝固后放于适宜的培养条件下进行培养。

2.4 数据统计及分析 用EXCEL软件、SPSS软件对所得数据进行统计分析，比较不同培养方法的显著性差异。

3 结果与分析

3.1 不同培养基对兼性厌氧微生物农药含量检测的影响 四种兼性厌氧微生物农药分别选用3种培养基、3种培养方法培养，然后进行含量检测。试验结果表明，在同一培养方法、3种不同的培养基中，甲基营养型芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌在NA培养基上的含量检测结果均极显著高于其他培养基(Duncan检验，P≤0.01)。多粘类芽孢杆菌采用涂平皿法和倒平皿法，NA培养基上的含量检测结果也极显著高于其他两种培养基(Duncan检验，P≤0.01)，平皿夹层法中NA培养基与2号培养基无显著差异(Duncan检验，P≤0.05)，而极显著高于LB培养基检测结果(Duncan检验，P≤0.01)。在对解淀粉芽孢杆菌进行含量检测中发现，4号培养基的含量检测结果极显著高于NA培养基和LB培养基(Duncan检验，P≤0.01)，而NA培养基的含量检测结果也极显著高于LB培养基(Duncan检验，P≤0.01)。

图1 甲基营养型芽孢杆菌芽孢含量不同培养基测定结果

图2 多粘类芽孢杆菌芽孢含量不同培养基测定结果

图3 侧孢短芽孢杆菌芽孢含量不同培养基测定结果

图4 解淀粉芽孢杆菌芽孢含量不同培养基测定结果注：不同大小写英文字母表示Duncan显著性检验分别达到0.01、0.05水平。

因此，在所选用的培养基中，NA培养基是测定甲基营养型芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌的最佳选择。而解淀粉芽孢杆菌的最适宜培养基为四号培养基。

3.2 不同培养方法对兼性厌氧生物农药含量检测的影响 使用NA培养基进行培养，甲基营养型芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌平皿夹层法和倒平皿法检测结果无显著差异(Duncan检验，P≤0.05)，但两种培养方法的检测结果均极显著高于涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)。多粘类芽孢杆菌3种培养方法均表现出极显著差异(Duncan检验，P≤0.01)，倒平皿法极显著高于平皿夹层法(Duncan检验，P≤0.01)，平皿夹层法极显著高于涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)。

使用LB培养基进行培养，甲基营养型芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌3种培养方法均无显著差异(Duncan检验，P≤0.05)。

使用特殊培养基进行培养，甲基营养型芽孢杆菌3种培养方法无显著差异(Duncan检验，P≤0.05)；多粘类芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌倒平皿法和平皿夹层法极显著高于涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)；解淀粉芽孢杆菌倒平皿法极显著高于平皿夹层法(Duncan检验，P≤0.01)，平皿夹层法极显著高于涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)。

图5 甲基营养型芽孢杆菌芽孢含量不同培养方法测定结果注：不同大小写英文字母表示Duncan显著性检验分别达到0.01、0.05水平。

3.3 各培养方式的变异系数分析 变异系数是指一组数据的标准差与其算术均数的比值或百分比，是反映某一总体各单位标示值的差异程度、集中或离散状况的常用统计量，一定程度上反映出试验数据的可靠程度。在进行生物农药含量检测时，变异系数也是需要考虑的指标。本研究中，所有培养方法检测结果的变异系数均<5%，其中涂平皿法的变异系数在1.94%～4.88%之间，平皿夹层法的变异系数在1.24%～4.89%之间，倒平皿法的变异系数在1.39%～4.99%之间(表4)。

表4 各培养方式的变异系数

(续)

4 结论与讨论

适宜的培养基是产孢细菌含量测定准确可靠的关键因素之一，而对于兼性厌氧微生物，适宜的培养条件更在一定程度上影响含量检测结果。本研究结果表明，针对甲基营养型芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌等3种兼性厌氧微生物农药，在选用的3种培养基中，NA为最适宜进行含量检测的培养基种类，而解淀粉芽孢杆菌的含量检测中推荐使用4号培养基。除培养基种类外，前处理方式、培养方法也会对含量检测产生重要影响，在使用NA培养基进行培养时，甲基营养型芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌平皿夹层法和倒平皿法含量检测结果极显著高于涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)，多粘类芽孢杆菌倒平皿法检测结果极显著高于平皿夹层法和涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)。对于解淀粉芽孢杆菌，当选用最佳培养基即4号培养基培养时倒平皿法检测结果极显著高于平皿夹层法和涂平皿法(Duncan检验，P≤0.01)。综上所述，甲基营养型芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌推荐在NA培养基上使用平皿夹层法或倒平皿法进行含量检测，多粘类芽孢杆菌含量检测推荐在NA培养基上使用倒平皿法，解淀粉芽孢杆菌推荐使用专用培养基即4号培养基进行倒平皿法检测。

培养基中所含碳源、氮源是微生物正常生长不可或缺的营养成分。碳源在微生物生长代谢过程中不仅为细胞提供基本的物质基础，参与细胞结构的组成，而且提供微生物生命活动中所需能源的原料[10]。氮源可以用来合成菌体生长代谢过程中的代谢中间产物，如核苷酸、氨基酸等，在进行微生物农药含量检测中要选择合适的碳源和氮源为微生物生长创造最佳条件。

本研究结果表明，甲基营养型芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌含量检测中最佳培养基均为NA。李潭[11]研究表明，复合氮源更有利于甲基营养型芽孢杆菌的生长，曹红等[12]对甲基营养型芽孢杆菌最佳氮源筛选中发现，牛肉膏较胰蛋白胨更利于菌株生长。因此推测NA培养基中的复合氮源牛肉膏和蛋白胨是含量检测结果较高的原因之一。检测甲基营养型芽孢杆菌所使用的1号培养基中含有可溶性淀粉和牛肉膏，虽然在含量检测中该培养基培养结果显著低于NA，但吴晶晶等[13]的研究发现，以淀粉作为碳源、牛肉膏作为氮源可使甲基营养型芽孢杆菌发酵液中具有更强的纤维素酶活性，表明为达到不同的试验目的应选用不同的培养基。马桂珍等[14]在对解淀粉芽孢杆菌发酵条件优化研究中发现，发酵培养后，NA较LB具有更高的菌体密度。洪鹏等人[15]研究也发现，解淀粉芽孢杆菌培养中最佳碳源和氮源分别是葡萄糖和酵母粉，这与4号培养基的成分相一致。

兼性厌氧微生物由于其特殊性，在好氧和厌氧条件下均能正常生长，在本研究中选用的四种兼性厌氧微生物农药中，平皿夹层法和倒平皿法均较涂平皿法检测结果高，表明厌氧条件更有利于对兼性厌氧微生物农药进行含量检测。