一种新型猪场消毒设备空间消毒效果的评价

王昌建，张鹏轩，2，马 沛，何世成，唐小明，胡巧云，彭 志，林 源，王卫国，刘道新

（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410014；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；3.湖南中净生物科技有限公司，湖南 长沙 410600）

我国畜禽养殖正在向集约化、规模化发展，动物疫病群防群控问题变得日益突出。在动物传染病防控过程中，消毒是消灭病原微生物的一种重要方式，彻底消毒能够有效切断传播途径，阻断传染病的传播。2018年10月非洲猪瘟传入我国，迅速在我国范围内传播，给养殖行业带来了灾难性的打击[1-3]。由于尚没有有效疫苗和药物防控，非洲猪瘟的防控主要依赖生物安全等级的提高，这也意味着养猪业对消毒技术和消毒效果提出了更高的要求[4]。

目前，市场上有各类消毒设备，大多数传统消毒设备将消毒剂呈水滴或雾滴形态喷洒出去，消毒后很难具有空间性与持续性。现有一种新型悬浮空间消毒技术，可将消毒剂结合增效剂形成纳米喷雾，能够均匀扩散到消毒空间的每个角落，在空气中悬浮时间持久，达到物体表面消毒和空间范围内彻底消毒的目的。因此，本研究主要评价悬浮空间消毒技术在物体表面及空间的消毒效果，验证其悬浮消毒喷雾持续消毒的可能性，以及该技术在实际生产环境中消毒的效果和实用性。

1 试验材料

1.1 消毒设备与消毒剂

使用的消毒设备为一种新型悬浮消毒机，使用的消毒剂为复方戊二醛（15%戊二醛、10%烃铵盐）、癸甲溴铵（50%），均购自幻影三陆零农牧科技有限公司。

1.2 主要试验器材与试剂

超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、冰箱、电子天平、生化培养箱、移液器、金黄色葡萄球菌29213菌株、营养琼脂培养基、生理盐水、棉拭子。

2 试验时间、地点与方法

2.1 试验时间与地点

试验分为实验室部分和猪场部分。实验室部分试验时间为2019年9—10月，地点是长沙市宁乡高新区。猪舍部分试验时间为2019年11—12月，地点是湖南省浏阳市淳口镇。

2.2 悬浮空间消毒技术在实验室消毒效果及持续消毒效果的评价方法

2.2.1 制备指示菌平皿 参照《兽用消毒剂鉴定技术规范》（1992）农（牧药）字第101号，选用金黄色葡萄球菌29213菌株为消毒试验指示菌。开封冻干菌种后，进行细菌繁殖体菌悬液的制备与活菌计量，通过菌液梯度稀释，每个稀释度做两个平行，在固体培养基上涂菌，37 ℃培养24 h，选平皿菌落可计数范围在30～300个，将计数结果换算成每毫升原液的菌量。原液计数后，将菌液稀释成所需浓度，取100 µL菌液接种到LB固体培养基表面，用灭菌的涂布棒涂布均匀，制备60～80个含有种子菌的平皿作为指示菌平皿。

2.2.2 试验场地 消毒试验选择在两个独立的实验室中进行，实验室1体积为54.46 cm3（长宽高为：626 cm×290 cm×300 cm），实验室2体积为57.75 cm3（长宽高为：500 cm×350 cm×330 cm）。试验组选用两种消毒剂（复方戊二醛与癸甲溴铵），使用悬浮空间消毒方式分两个实验室同时进行消毒；待消毒剂在实验室彻底散除后，再次选用复方戊二醛使用常规喷洒消毒作为对照组。消毒前将房间密闭，分开放置指示菌平皿于房间内5个不同位点，不同高度。指示菌平皿放置高度下见表1。

表1 实验室空间放置的指示菌平皿高度

2.2.3 消毒方法 试验所用消毒剂复方戊二醛与癸甲溴铵以及增效剂依据厂家说明，量取实验室所需剂量。对照组常规喷洒消毒所用消毒剂依据厂家说明稀释到相应比例后使用喷雾消毒工具进行喷洒；试验组所用消毒剂无需稀释，开机对房间进行消毒。

2.2.4 试验分组与设计 为比较悬浮空间消毒技术与常规喷洒消毒的消毒效果，试验组与对照组消毒喷雾后，在固定的时间打开房间，取出和放入对应分组的指示菌平皿。消毒时间段0～0.5 h、0～1 h，代表作用0.5 h、1 h对指示菌平皿的影响。为进一步验证悬浮空间消毒技术在空间与物体表面的持续消毒效果，在消毒喷雾完成1 h、2 h后，再分别放进新的指示菌平皿消毒1 h，看空间悬浮消毒剂是否能继续具有消毒作用，消毒时间段为1～2 h、2～3 h。试验所用指示菌平皿分批分次放入和拿出，具体分组下见表2。

表2 指示菌平皿分组

2.2.5 平皿培养计数 消毒试验结束后，将所有组的指示菌平皿与对比参照平皿，放置37 ℃恒温培养箱中培养24 h，培养后对每个平皿进行计数，统计结果。

2.2.6 杀菌率判定

2.3 悬浮空间消毒技术在猪舍中消毒效果的评价方法

2.3.1 制备指示菌平皿 制备方法同2.2.1，制备20～40个含有种子菌的平皿供消毒试验使用，准备100个空的营养琼脂平皿培养基供空气沉降消毒试验使用。

2.3.2 试验场地 浏阳市某猪场进行试验，试验猪舍长200 m、宽20 m，舍内设备配套齐全。选择2个猪舍（图1），猪舍A体积为98.68 m3（长宽高为2.67 m×4.2 m×8.8 m），猪舍B体积为84.00 m3（2.58 m×3.7 m×8.8 m）。每个猪舍相对密闭隔离，不对猪舍进行前期消毒，将猪分别饲喂在2个猪舍，饲养1个星期后，把试验动物赶离隔离猪舍进行饲养。消毒前对畜禽圈舍进行冲洗，冲洗干净后空出场地用于表面消毒和空气消毒试验。

图1 试验场地平面示意

2.3.3 试验分组 复方戊二醛组：使用悬浮空间消毒技术在密闭猪舍A内进行表面与空气消毒试验。癸甲溴铵组：使用悬浮空间消毒技术在密闭猪舍B内进行表面与空气消毒试验。

2.3.4 表面消毒试验

（1）物体表面环境菌采样：消毒前与消毒4 h后分别在畜禽圈舍取5个位点采样，分别为地面2个点、食槽2个点和墙面，取样时将棉拭子用生理盐水浸润后，在面积为5 cm×5 cm的地面或其他物体表面横直各用力擦拭10次，并不断转换拭子擦拭面，把拭子棉花端剪入1 mL采样液内用力振摇100次（振荡器30 s），将菌洗脱，洗液以生理盐水10倍稀释3个梯度，分别在营养琼脂涂布均匀后放置于37 ℃恒温培养箱培养24 h后作活菌计数。

（2）物体表面指示菌试验：消毒前在畜禽圈舍内选择不同高度的5个位点放置涂布有指示菌的平皿，5个点分别为栏杆高低2个位点、食槽、地面和窗台，每个采样点放置2个平皿，一共放置10个营养琼脂平皿，消毒0.5 h、4 h后各取出一批平皿，放置于37 ℃恒温培养箱培养24 h后作活菌计数（表3）。

表3 猪舍表面消毒指示菌平皿位置高度 cm

2.3.5 猪舍空气细菌消毒试验 采用平板沉降法采样，在消毒前后圈舍内离地面1 m的高度的不同位置放置空营养琼脂平皿，打开平皿（平皿盖至于皿底，不可仰放，防止污染），每个平皿暴露于空气中，一共放置5个，同时放一个空的营养琼脂培养平皿于桌面上不启盖，以作对照。15 min后，依次盖好平皿，记录每组采样时间，保证每组采样时间基本一致。消毒1 h后（不开门窗）采用同样的采样方法、位置、次数、间隔时间、采样时间等，采样后的平皿置于37 ℃的恒温培养箱培养24 h后作活菌计数。

2.3.6 杀菌率的计算

（1）表面消毒试验杀菌率：

（2）空气细菌消毒试验杀菌率：空气细菌总数（cfu/m3）=N×50 000/（A×T）。式中：N为平皿菌落数，A为平皿面积（cm2），T为平皿暴露时间（min）。

3 试验结果

3.1 实验室内两种消毒方式杀灭指示菌结果

3.1.1 金黄色葡萄球菌原液计数结果 通过将目标菌菌液进行10倍的梯度稀释，选择合适的稀释倍数进行涂板、计数，最终确定的菌液中菌落数以及指示菌平皿上的菌落数如表4所示。

表4 金黄色葡萄球菌计数结果

3.1.2 两种消毒方式的消毒效果比较 通过两种不同消毒设备、不同消毒剂消毒喷雾后，消毒喷雾作用0.5 h、1 h对指示菌平皿的影响，最终确定这两种消毒方式的杀菌率。结果显示，试验组用复方戊二醛对实验室消毒，悬浮空间消毒的指示菌平皿在实验室暴露0.5 h、1 h后，活菌数均为0，对指示菌杀灭率均为100%；试验组用癸甲溴铵消毒，悬浮空间消毒的指示菌平皿在实验室暴露0.5 h、1 h后，活菌数均为0，对指示菌杀灭率均为100%。对照组用复方戊二醛对实验室消毒，喷壶喷洒消毒的指示菌平皿在实验室暴露0.5 h、1 h后，活菌数均为0，对指示菌杀灭率均为100%。试验表明，两种消毒方式在实验室作用0.5 h或1 h，均对指示菌有明显的杀菌作用，杀菌率均为100%（表5）。3.1.3 两种消毒方式消毒后持续消毒效果研究 两种不同消毒设备、不同消毒剂分别在消毒喷雾后1 h、2 h，在实验室5个位点再放入新的指示菌平皿，消毒喷雾作用时长为1 h，验证悬浮的消毒喷雾是否还有消毒作用，以及消毒喷雾持续消毒效率。结果显示，癸甲溴铵组这两个时间点放入的指示平皿培养后均没有菌落生长；复方戊二醛组使用分析悬浮消毒技术后，1 h放入的平皿没有菌落，2 h放入的平皿有3～8个零星的菌落；常规喷洒复方戊二醛组的平皿上都长出了菌苔，大于300个菌落，见表6。

表5 悬浮空间消毒方式和喷壶喷洒消毒方式消毒结果对比

表6 两种消毒方式持续消毒结果

试验结果表明，常规喷洒消毒在对实验室消毒1 h后，对新的指示菌平皿杀菌效果显著下降，杀菌率低于98.5%；悬浮空间消毒技术在对实验室消毒后3 h内，仍具有较强的杀菌作用，对新的指示菌平皿杀菌率达到99.9%以上。

3.2 猪舍物体表面消毒与空气消毒试验结果

3.2.1 金黄色葡萄球菌原液计数结果 通过将菌液进行10倍的梯度稀释，选择合适的稀释倍数进行涂板、计数，菌液浓度为1.9×109cfu/mL， 涂布指示菌平皿上的菌量为1.9×104cfu。

3.2.2 猪舍物体表面消毒试验结果

（1）两种消毒剂对指示菌平皿的杀菌结果。悬浮空间消毒技术使用两种不同消毒剂，分别在密闭猪舍消毒喷雾后，消毒喷雾作用0.5 h、4 h对指示菌平皿的影响，最终确定不同消毒剂的杀菌率。结果显示，用复方戊二醛悬浮空间消毒方式对密闭猪舍消毒，指示菌平皿在密闭猪舍暴露0.5 h，4个指示菌平皿均没有长出菌落，1个平皿长出61个菌落；指示菌平皿在密闭猪舍暴露4 h后，5个指示菌平皿菌没有菌落生长。悬浮空间消毒技术用癸甲溴铵消毒，指示菌平皿在密闭猪舍暴露0.5 h、4 h后，10个指示菌平皿都没有菌落生长，表明平皿上的细菌都被杀灭（表7）。试验表明，悬浮空间消毒技术用两种消毒剂在密闭猪舍内作用0.5 h，即对指示菌有明显的杀菌作用，杀菌率均大于99%；作用4 h后，指示菌杀菌率均达到100%。

表7 猪舍环境消毒后指示菌计数结果

（2）两种消毒剂对物体表面菌的杀菌结果。用两种不同消毒剂，分别在密闭猪舍消毒，消毒前后分别在食槽、墙面、地面等地方采样、培养细菌后计数，计算出取样面积内的菌量，计算确定不同消毒剂的对密闭猪舍不同位置物体表面菌的杀菌率。结果显示，用复方戊二醛消毒剂采用悬浮空间消毒的方式对密闭猪舍消毒，对地面上细菌杀灭率均能达到97.6%以上，对墙面上细菌杀灭率均能达到99.6%以上，对食槽上细菌杀灭率能达到100%。消毒对猪舍物体表面菌的杀菌率平均能达到99%以上。

悬浮空间消毒设备用癸甲溴铵消毒剂对密闭猪舍消毒，对地面上细菌杀灭率均能达到98.2%以上，对墙面上细菌杀灭率均能达到95.6%以上，对食槽上细菌杀灭率能达到99.2%以上。消毒对猪舍物体表面菌的杀菌率平均能达到98%以上（表8）。

表8 猪舍消毒后物体表面的指示菌计数结果

试验表明，悬浮空间消毒技术用两种消毒剂在密闭猪舍内消毒后，即对猪舍地面、墙面、食槽等表面菌有明显的杀菌作用，杀菌率均大于98%。

3.2.3 猪舍空气消毒试验结果 使用两种不同消毒剂，分别在密闭猪舍消毒，消毒前后分别在圈舍内离地面1 m高的5个位点放置无菌营养琼脂平皿、培养细菌后计数，计算确定不同消毒剂对密闭猪舍空气中细菌的杀菌率。结果显示，悬浮空间消毒技术采用复方戊二醛消毒剂对密闭猪舍消毒，消毒前空气中的平均菌数为8.5×103cfu/cm3，消毒后空气中的平均菌数为1.8×102cfu/cm3。消毒对空气中细菌的杀菌率能达到97.9%以上。悬浮空间消毒技术采用癸甲溴铵消毒剂对密闭猪舍消毒，消毒前空气中的平均菌数为5.8×103cfu/cm3，消毒后空气中的平均菌数为4.6×102cfu/cm3。消毒对空气中细菌的杀菌率能达到92.1%以上（表9）。

表9 猪舍消毒后舍内空气菌计数

试验表明，应用悬浮空间消毒技术经两种消毒剂在密闭猪舍内消毒后，对猪舍空气中细菌有明显的杀菌作用，均能达到90%以上，复方戊二醛对空气中细菌的杀菌作用略为明显。

4 讨论

随着我国养殖业的发展，生物安全问题在猪场养殖业中愈发重要，高效高质量的消毒设备更能为猪群健康成长保驾护航。本研究通过实验室与猪舍消毒试验，对一种新型的悬浮空间消毒技术的杀菌效能、适用性进行评价研究，结果显示其在实验室和猪舍对于物体表面和空间都有很好的消毒效果。

该技术与传统喷洒或超声波的消毒方式相比较，创新之处在于增加了增效剂，集成微泵技术将常用的化学消毒剂形成悬浮状消毒喷雾，消毒喷雾可以充满消毒的空间，并在空间内长时间悬浮，通过调节消毒剂喷雾的浓度和消毒的有效作用时间，可以达到预期的消毒效果。这种消毒方式将消毒剂最大程度地送到空间每个接触面，还能实现消毒剂在空间长时间悬浮，实现空间的空气和物体表面同时消毒，解决了以往喷雾消毒作用时间不能保证、消毒面不确定是否均匀的问题，让消毒可以做到更专业、更可控、更有效。

在当前非洲猪瘟疫情背景下，猪病形势严峻，势必需要明确消毒效果保证猪场生物安全体系的有效执行。新型的消毒设备可以通过控制喷射时间定量消毒剂验证消毒效果，为猪场有效消毒提供了技术支撑和强效的工具。空间消毒的性能较高，可供猪场生产中的空间和物体表面消毒，如猪舍、仓库、办公室、药品房、车辆等地方消毒使用。该设备操作简单，一键启动，应用于生产一线，大幅提高了工作人员的消毒效率。