单一或复合益生菌对小鼠免疫机能的影响

黎雨晴，汪泽坤，杨恩东，骆广财，孙冬冬

（1.安徽农业大学 生命科学学院，安徽合肥 230036；2.安徽亨博士保健食品有限公司，安徽阜阳 236000）

益生菌因对宿主具有多重益处而被认为是抗生素的天然替代品，其功能和作用机制备受关注。随着各种有益微生物的不断发现，研究人员对益生菌的生物学特性、功能和安全性进行了详细的研究[1-4]。研究发现，益生菌在调节肠道菌群、预防慢性病、提高机体免疫力等方面具有一定的作用，是良好的免疫激活剂。其不仅可以改善宿主肠道菌群微生态平衡，还可以改善肠道黏膜表面的屏障功能，以促进免疫细胞的活化和免疫机能的产生，其增强巨噬细胞吞噬功能已广泛应用于人类和动物保健与疾病防治过程[5-11]。目前，益生菌已经被广泛应用于各领域中，在人畜保健与某些疾病防治方面发挥着越来越重要的作用。虽然研究已经证实了益生菌具有免疫保护增强的作用[12]，但在益生菌个性化精准补充的倡导下，针对复合益生菌免疫的研究尚不完善。因此，本实验研究了单一或复合益生菌对小鼠免疫机能的影响，为益生菌微生态制剂产品的合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品

本实验所用益生菌包括嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、长双歧杆菌，均来自安徽农业大学生物制药系。复合益生菌制剂由嗜酸乳杆菌（1×107CFU/g）、戊糖乳杆菌（1×107CFU/g）、长双歧杆菌（1×107CFU/g）构成。

1.2 试剂与仪器

MRS培养基，FMB级，生工生物工程上海有限公司；莫匹罗星、环丙沙星、氯林可霉素、L-半胱氨酸盐酸盐、碳酸钙、4%多聚甲醛，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；AST等生化试剂盒，北京安普生化有限公司；IL-2等ELISA试剂盒，上海麦克林生化科技有限公司。

GTZ-CJ超净工作台，海南龙口有限公司；Allegra 64R台式冷冻离心机，贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；JM-54R全自动高压蒸汽灭菌锅，施都凯仪器设备（上海）有限公司；Multiskan FC酶标仪，赛默飞世尔上海（仪器）有限公司。

1.3 培养基

含X-GAL的BSM培养基（X-BSM）：在MRS培养基（1 L）中加入500 mg的L-半胱氨酸盐酸盐、50 mg的莫匹罗星和60 mg的X-GAL。

含碳酸钙的MRS培养基（Ca-MBS）：MRS培养基（1 L）中添加5 g碳酸钙。

含环丙沙星-氯林可霉素的MRS培养基（C-MBS）：MRS培养基（1 L）中加入10 mg的环丙沙星和0.1 mg的氯林可霉素。

1.4 实验动物

本实验中的SPF级雄性昆明小鼠（体重25～30 g，6周龄）由南京麦瑞斯生物科技有限公司提供。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》和安徽农业大学实验动物中心批准的方案进行。

1.5 实验模型的建立及分组

取SPF级雄性昆明小鼠90只，适应性饲养1周后，随机抽取15只小鼠继续普通喂养，作为正常组，剩下的75只小鼠连续三天使用环磷酰胺（60 mg/kg）腹腔注射，期间维持正常的进食进水，制造免疫低下模型。以小鼠出现体形瘦弱、大量脱毛、精神萎靡等现象作为造模成功的标准。造模成功后，将75只造模小鼠随机分为5组：免疫低下模型组、嗜酸乳杆菌治疗组、戊糖乳杆菌治疗组、长双歧杆菌治疗组和复合益生菌治疗组，每组15只。分别使用单一益生菌制剂（3×107CFU）或复合益生菌制剂（1 g）加入1 g的生理盐水、对小鼠进行灌胃处理，每天一次，连续灌胃28 d，记录各组小鼠的体重。

1.6 免疫功能检测

1.6.1 小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的测定

在小鼠尾部静脉注入稀释后的墨汁，分别在注射墨汁后的2 min 和10 min从小鼠眼眶静脉采血，血液标本用酶标仪测定680 nm处吸光值。小鼠称重后处死，在超净工作台中解剖取出肝脏和脾脏，用生理盐水洗去表面血污后称重记录。按公式（1）和（2）计算碳廓清指数（K）和吞噬指数（α）：

其中，OD1和OD2分别为t1（2 min）和t2（10 min）时刻血液标本的吸光度值，体重、肝重和脾重单位均为g。

1.6.2 免疫器官指数的测定

常规眼球采血后处死小鼠，在超净工作台中解剖取出脾脏和胸腺，用生理盐水洗去表面血污后称重记录。按公式（3）和（4）计算脾指数和胸腺指数：

其中，脾重和胸腺重单位为mg，体重单位为g。

1.6.3 小鼠血清生化指标测定

取各组小鼠血清样本，严格按照试剂盒操作规定检测小鼠血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清肌酐（CREA）和尿素氮（UREA）含量。

1.6.4 小鼠血清细胞因子含量测定

血清细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ）含量按照ELISA试剂盒方法进行测定。

1.7 数据处理

实验数据用均值±标准差表示，SPSS 26.0软件进行统计学分析，不同实验组之间的差异分析采用ANOVA，P＜0.05和P＜0.01判断为差异显著和差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单一或复合益生菌对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

巨噬细胞是一种抗原呈递细胞，通过分泌细胞因子实现免疫细胞的增殖与分化，提高机体免疫能力[13]。如表1所示，免疫低下模型组小鼠碳廓清指数6.52±0.02，与正常组小鼠碳廓清指数相比下降了13.53%（P＜0.05），说明环磷酰胺使小鼠的单核巨噬细胞吞噬能力下降，表明造模成功；各单一益生菌组（嗜酸乳杆菌组、戊糖乳杆菌组和长双歧杆菌组）小鼠碳廓清指数与免疫低下模型组相比均显著升高（P＜0.05），各组分别升高了11.92%、14.81%和16.52%；复合益生菌组小鼠碳廓清指数与免疫低下模型组相比升高了30.91%（P＜0.01）。结果表明，单一或复合益生菌能不同程度提高小鼠的非特异性免疫功能，复合益生菌提高效果更显著，约为各单一益生菌组的2倍。这一结果表明复合益生菌能有效增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力，这可能与益生菌共同作用提高了免疫蛋白的分泌，促使肠黏膜淋巴细胞的增殖，增强了巨噬细胞功能有关[14]。

表1 益生菌对小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响

2.2 单一或复合益生菌对小鼠免疫器官指数的影响

免疫器官指数是衡量机体免疫功能的指标之一，其中脾指数和胸腺指数主要反映免疫细胞的功能和免疫器官的发育，间接反映了机体的免疫水平[15]。

如表2所示，免疫低下模型组脾指数（3.98±0.43）mg/g，与正常组相比降低了30.91%（P＜0.01），进一步证明了免疫低下小鼠模型造模成功；嗜酸乳杆菌组、戊糖乳杆菌组和长双歧杆菌组脾指数分别为（4.43±0.34）mg/g、（4.71±0.72）mg/g 和（4.68±0.56）mg/g，与免疫低下模型组相比均出现了显著升高（P＜0.05），复合益生菌组更是升高至（6.52±2.47）mg/g，增加了63.82%（P＜ 0.01）。各益生菌处理组与模型组相比，胸腺指数均有所升高，其中戊糖乳杆菌组、长双歧杆菌组分别升高20.25%和21.52%，复合益生菌组升高了62.66%（P＜0.01）。

表2 益生菌对小鼠免疫器官指数的影响（mg/g）

结果表明，单一或复合益生菌能够在不同程度上提高免疫低下小鼠的脾指数和胸腺指数，增强免疫低下小鼠脾脏和胸腺的免疫机能，且复合益生菌治疗效果更显著。

2.3 单一或复合益生菌对小鼠血清四项生化指标的影响

如表3所示，免疫低下模型组小鼠与正常组小鼠相比，血清四项生化指标含量均有所升高，其中ALT含量上升了14.49%（P＜0.05），AST、UREA含量分别上升了9.78%和10.58%（P＜0.01），表明造模主要对小鼠的肝功能造成损伤；与免疫低下模型组相比，除嗜酸乳杆菌组小鼠血清中CREA水平无明显变化、戊糖乳杆菌和长双歧杆菌组CREA水平显著上升外，益生菌处理组小鼠血清中AST、ALT、UREA和CREA水平均出现了显著下降（P＜0.01），且复合益生菌组血清生化指标最接近正常组。

表3 益生菌对小鼠血清生化指标的影响

实验结果表明，单一或复合益生菌都能够维持肝肾的正常代谢，有效调节免疫低下模型小鼠的免疫机能，且复合益生菌组的调节效果更显著。这可能是因为复合益生菌中含有多种营养因子，各种养分和代谢产物均通过血液进行交换，这些因子对生物膜结构有保护作用，复合益生菌营养成分较单一益生菌更多，更能有效改善小鼠胃肠道环境，提高机体免疫功能[16]。

2.4 单一或复合益生菌对小鼠血清细胞因子含量的影响

机体免疫应答中，Th1细胞主要参与细胞免疫，Th2细胞主要参与体液免疫，每种细胞产生的细胞因子相互拮抗，当细胞因子失调，从Th1移向Th2，机体就会处于免疫抑制状态[17]。

如表4所示，免疫低下模型组血清细胞因子IL-2、IFN-γ分泌水平为（0.61±0.33）ng/mL和（3.31±0.90）ng/mL，分别下降了64.33%和50.74%（P＜0.01）；血清细胞因子IL-4和IL-6分泌水平升高至（7.34±0.81）ng/mL和（10.90±0.63）ng/mL，与正常组相比升高极显著（P＜0.01）。结果表明，造模后的小鼠Th1型细胞因子含量下降，Th2型细胞因子含量升高，导致机体免疫平衡向Th2的方向移动，抑制了造模小鼠的免疫机能，进一步证明了小鼠模型成功造模。

与免疫低下模型组相比，单一益生菌组血清细胞因子IL-2分泌水平显著升高（P＜0.05），IFN-γ含量分别增加了1.49倍、1.55倍和1.30倍，分泌水平升高极显著（P＜0.01）；戊糖乳杆菌和长双歧杆菌对IL-4和IL-6分泌水平的降低效果极显著（P＜0.01）；复合益生菌的影响更大（P＜0.01），IL-4、IL-6分泌水平分别下降了41.96%和25.32%，IL-2和IFN-γ分泌水平则分别上升了1.97倍和2.12倍。

表4 益生菌对小鼠血清细胞因子含量的影响（ng/mL）

结果表明，给予造模小鼠益生菌灌胃处理后，单一或复合益生菌组都对血清细胞因子含量产生了不同程度的影响，改善小鼠因造模受到的机体损伤，有效恢复或提高小鼠免疫机能。其中，复合益生菌组比单一益生菌组免疫力改善效果更好。这可能是因为不同益生菌分泌和调节的效应分子不同，这些效应分子相互作用，直接或间接地调节肠道环境，提高机体整体免疫调节能力[18]。

3 结论

以往，研究集中于益生菌作为饲料添加剂发挥保护肠道和促进消化等功能。随着相关研究的深入，利用生理优势菌或机体非常驻菌及其代谢产物来预防和治疗某些疾病的微生态治疗概念被提出[19]。

本研究用环磷酰胺建立免疫低下小鼠模型，分别用单一益生菌（嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌、长双歧杆菌）和复合益生菌对小鼠进行灌胃，发现单一益生菌和复合益生菌均能够显著提高免疫低下小鼠的非特异性免疫功能，能够改善小鼠的肝肾功能损伤，且复合益生菌的效果优于单一益生菌。复合益生菌的具体调节机制与剂量、配比和免疫系统自身调节的复杂性有关，有待进一步研究。