机械性窒息大鼠脑组织中GRP78和miR-199a的表达

2022-08-06陈瑶清冯雪英孙佳胜何海军李剑波

生物化工 2022年3期

陈瑶清，冯雪英，孙佳胜，何海军，李剑波*

（1.湖南警察学院，湖南长沙 410013；2.湖南省长沙市公安局刑侦支队，湖南长沙 410013）

机械性窒息会引起脑内蛋白质和mRNA的改变[1-3]。葡萄糖调节蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78），又称为重链结合蛋白（Heavy-Chain Binding Protein，Bip），是热休克蛋白70的一种。GRP78是一种内质网伴侣蛋白，是内质网内未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）的重要调节蛋白之一[4-5]。非应激状态下，GRP78与三个未折叠蛋白反应的跨膜感应蛋白（ATF6、PERK和IRE1）相结合，若未折叠或错误折叠蛋白在内质网内大量积聚，GRP78则与跨膜蛋白分离，激活三条未折叠蛋白反应通路，以降低蛋白翻译水平和增加内质网负荷能力。若内质网内不能维持动态平衡，则引起相关细胞凋亡通路激活[6]。UPR在许多疾病中具有重要的作用[5,7-11]，GRP78在脑缺血、脑缺氧和退行性疾病中具有神经保护作用[11-14]。

微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一段内生性的、非编码的、长度20～24个核苷酸的小RNA，miRNA通过降解靶mRNA，抑制靶mRNA翻译（RNA interference，RNAi）[15]或促进靶mRNA翻译（RNA activation，RNAa）[16]从而调节基因的表达。miRNA调控很多重要的生理病理过程，包括细胞增殖、分化、生长和死亡[17-18]。缺血和缺氧会引起脑内大量miRNA的改变[19-23]。近些年，研究有关miRNAs在内质网应激中作用的报道也日益增多[24-25]。

根据生物信息学软件预测及相关研究报道可知，GRP78蛋白是miR-199a的靶基因。通过研究GRP78和miR-199a在机械性窒息大鼠各脑区中的表达情况，了解内质网应激及上游miRNA在机械性窒息中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

24只雄性SD大鼠，体重（256.8±10.0）g。大鼠均从中山大学实验动物中心购买，并在中山大学中山医学院SPF实验室内饲养。饲养环境：恒定温度（24 ℃±2 ℃）、恒定光照（12 h光照—12 h黑暗交替），食物和水充足。

1.2 仪器与试剂

ASP300S型全自动脱水机，德国Leica；HistoCore Arcadia型石蜡包埋机，德国Leica；HistoCore BIOCUT R型石蜡切片机，德国Leica；SZX10型普通光学显微镜及配套照相系统，日本Olympus；5810R型台式高速冷冻离心机，美国Eppendorf AG；TissueLyser Ⅱ型高通量组织研磨器，德国QIAGEN；ImageQuant LAS 4000型荧光、化学发光成像分析系统，美国GE Healthcare；OrionTMAquaMate型超微量紫外、可见光分光光度计，美国ThermoFisher Scientific；IQ5型实时荧光定量PCR系统，美国BIO-RAD；NanoDrop 2000C超微量分光光度计，美国ThermoFisher Scientific。

RNeasy mini试剂盒、miScriptⅡ RT试剂盒和miScript SYBR Green PCR试剂盒，德国Qiagen；Anti-GRP78 BiP抗体，美国Abcam；小鼠单克隆抗β-actin抗体，美国Sigma；HRP山羊抗兔IgG（H+L）抗体，美国GeneCopoeia；HRP马抗鼠IgG抗体，美国CST；DAB检测试剂盒，基因科技（上海）股份有限公司。

1.3 动物模型

实验前大鼠禁食约12 h，允许其自由饮水。

对照组（n=12）：按照300～350 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠后快速断颈。

勒死组（n=12）：按照300～350 mg/kg剂量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。将棉线圈套在大鼠颈部，用棉签棒穿过棉线圈。朝一个方向旋转棉签棒，使大鼠颈部受到绞勒，并维持线圈对大鼠颈部的压力，直至大鼠死亡。大鼠平均死亡时间约3 min。

本实验通过了中山大学中山医学院实验动物福利伦理审查。

1.4 免疫组化染色

取大鼠（n=12：勒死组n=6，对照组n=6）大脑于10%甲醛溶液中固定，进而脱水、包埋制成蜡块，以4 μm厚度进行切片。Anti-GRP78 BiP抗体200倍稀释，4 ℃过夜孵育，使用DAB试剂盒进行显色。形态学定量研究所使用的照片均为400×免疫组化图片，每例随机选取10个视野，并使用ImagePro Plus软件计算IOD值。

1.5 Western Blot检测

提取大鼠（n=12：勒死组n=6，对照组n=6）左侧各区脑组织蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。总蛋白量为20 μg，上样量为20 μL，进行SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，PBST洗脱3次。加入Anti-GRP78 BiP抗体（1∶2 000稀释），4 ℃缓慢摇动过夜。用PBST洗脱3次，加入1 mL山羊抗兔抗体（1∶2 000）孵育1 h，用PBST洗脱3次，采用ImageQuant Las4000mini进行显影。β-actin作为内参，一抗和二抗分别为抗β-Actin抗体（1∶5 000）、马抗鼠抗体（1∶2 000）。采用ImagePro Plus软件测灰度值。以GRP78/β-actin IOD值为GRP78的相对表达量。

1.6 miR-199a的荧光定量PCR检测

取大鼠（n=12：勒死组n=6，对照组n=6）右侧各区脑组织于RNA组织样本液中，置于-80 ℃冰箱保存。大脑各区分别取40 mg组织，采用RNeasy mini试剂盒提取总RNA，超微量分光光度计进行RNA定量。采用The miScript Ⅱ RT试剂盒将RNA逆转录为cDNA，采用miScript SYBR Green PCR试剂盒和U6（内参）、miR-199a-3p、miR-199a-5p引物进行荧光定量PCR，以检测目的miRNA的表达量。通过IQ5型实时荧光定量PCR系统获得扩增曲线和熔解曲线以明确扩增产物的特异性和表达量，2（-ΔΔCt）方法计算miR-199a的相对表达量。

1.7 统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以均值±标准差的形式表示。若样本符合正态性分布，则采用t检验，否则采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05表示数据间具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 大鼠脑组织内GRP78的免疫组化染色

大鼠脑组织的免疫组化结果如图1所示。GRP78蛋白在勒死组的皮质、海马和中脑组织的神经元胞浆中强表达，在对照组的皮质及中脑组织中未见强烈表达；无论在对照组还是勒死组，海马区域的GRP78蛋白均为强阳性表达。

图1 大鼠皮质、海马、中脑中GRP78蛋白的表达情况（400倍视野）

如图2所示，采用IOD值进行半定量分析发现，与对照组相比，勒死组大鼠皮质和中脑的GRP78显著升高（P＜0.01），而海马中GRP78表达量的改变不具有统计学差异（P＞0.05）。

图2 GRP78在对照组和勒死组大鼠皮质、海马、中脑区的IOD值

2.2 大鼠脑组织内GRP78的Western Blot定量

GRP78蛋白在两组大鼠皮质、海马和中脑的表达量见图3。与免疫组化结果相似，勒死组大鼠皮质和中脑区的GRP78/β-actin相对密度值较对照组显著升高（P＜0.05），而两组大鼠海马区GRP78/β-actin相对密度值不具有统计学差异（P＞0.05）。

图3 GRP78和β-actin在大鼠脑组织表达的Western Blot结果

2.3 miRNA的定量

如图4所示，与对照组相比，勒死组大鼠皮质和中脑区中miR-199a-3p的表达量较对照组显著下降（P＜0.05），而海马区miR-199a-3p的表达量较对照组不具有统计学差异（P＞0.05）。勒死组和对照组大鼠皮质、海马和中脑区miR-199a-5p的表达量均无统计学差异（P＜0.05），数据未展示。

图4 miR-199a-3p在大鼠皮质、海马和中脑的相对表达量

3 讨论

在勒死过程中，由于勒索对颈部动、静脉和气管的压迫，大脑经历缺血、缺氧的病理过程，引起神经元细胞对缺血、缺氧的应激反应。在慢性脑缺血中，皮质和纹状体在脑缺血12 h后GRP78蛋白表达显著升高[26]，缺血灶中心GRP78蛋白减少，但缺血灶边缘GRP78蛋白增加[25]。慢性缺氧48 h后，海马细胞中GRP78蛋白表达增加[27]，而间歇性缺氧2周后皮质和海马区GRP78 mRNA显著升高[11]。在本实验（急性缺血缺氧）中，GRP78在大鼠皮质和中脑的表达量显著增加，海马区GRP78的改变不具有统计学差异，说明在勒死的过程中，内质网应激被激活，且在皮质和中脑部位尤为强烈，与课题组前期机械性窒息大鼠脑内葡萄糖代谢分布的研究结果相似[28]。而对照组和勒死组海马区GRP78异常高表达可能与存在生理性表达的GRP78蛋白有关，具体原因有待进一步的研究。在勒死与其他死因的对比研究中，如果使用全脑组织进行评价，由于海马区域高表达的GRP78蛋白会引起结果的误差或假性，建议选择皮质和中脑区域的脑组织进行分析。

研究指出，缺血会引起神经元和星形胶质细胞中GRP78的升高[29]，而缺氧只引起神经元细胞中GRP78蛋白表达升高[30]。在本实验中，GRP78只在神经元细胞胞浆内表达。一方面，勒死致颈静脉完全阻塞，导致脑内缺血缺氧，大量未折叠或错误折叠蛋白积聚于内质网内，GRP78与IRE1、PERK和ATF6三个感应蛋白分离，与未折叠或错误折叠蛋白结合，维持细胞内稳态。另一方面，高表达的GRP78通过抑制钙离子从内质网向线粒体的转运，减少线粒体内自由基的产生，对细胞有保护作用[31]。若神经元细胞内稳态不能维持，则激活相关细胞凋亡通路，引起细胞的死亡。

在脑缺血中，脑内多种miRNA表达量发生改变[20-23]。而在脑缺氧中，大脑皮质miR-199a表达量下降[19]。miR-199a-3p是与缺氧密切相关的miRNA，缺氧会引起miR-199a-3p的下降[32-33]。在本研究中，大鼠皮质和中脑区域miR-199a-3p显著下调。miR-199a-3p对MEK/ERK和mTOR信号通路具有负性调控作用[34-35]，当未折叠蛋白反应不足以维持细胞内稳态时，内质网应激可以通过抑制MEK/ERK和mTOR信号通路激活而引起细胞的自噬和凋亡[36-37]。勒死过程中，大鼠的皮质和中脑发生内质网应激，miR-199a-3p显著下降，可能通过上调MEK/ERK和mTOR信号通路蛋白抑制神经元细胞的凋亡和自噬，对神经元起保护作用。

根据生物信息学软件预测可知GRP78蛋白受上游miR-199a-5p调控，也有研究证实在肿瘤细胞和肝细胞内，miR-199a-5p对GRP78蛋白具有调控作用，参与未折叠蛋白反应[24-38]。本研究发现，GRP78蛋白在皮质和中脑区表达量显著下降，而miR-199a-5p在各脑区的表达未见统计学差异。一方面，在急性应激情况下，GRP78蛋白与IRE1、PERK和ATF6分离，与未折叠蛋白大量结合，导致GRP78蛋白表达升高，而mRNA水平可能未有显著变化；另一方面，GRP78蛋白可能同时受多个miRNA的调控[24]。