山羊莫拉菌的分离鉴定及药物敏感性分析

庄科勤 ， 董文龙 ， 沙万里 ， 徐菁岐 ， 卢殿杰 ， 孟雨晴 ， 高学勇 ， 付连军

(1.吉林农业科技学院动物科技学院 ， 吉林 吉林 132109 ； 2.吉林市丰满区动物疫病预防控制中心 ， 吉林 吉林 132013)

近年来，关于莫拉菌在临床上的致病报道日益增多，该菌多寄生在人体和哺乳动物的呼吸道，为条件性致病菌。当机体免疫力低下时，多数莫拉菌可单独或与其他细菌共同引起疾病，尤其是在幼儿及老年中较为常见[1]。与人类疾病密切相关的莫拉菌中，卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)是儿童呼吸道感染的第3位常见致病菌，并会引发败血症、脑膜炎、肺炎、自发性腹膜炎等；腔隙莫拉菌(Moraxellalacunae)可引发结膜炎、慢性鼻窦炎、心内膜炎等；非液化莫拉菌(Moraxellanonliquefaciens)可引发角膜炎；奥斯陆莫拉菌(Moraxellaosloensis)和亚特兰大莫拉菌(Moraxellaatlantae)可导致败血症[2-8]。

有学者发现，山羊莫拉菌可与某些致病菌共同作用引起山羊红眼病[9]。此外，国外曾有儿童因感染该菌而导致心内膜炎发生的报道[10]。但就目前的资料来看，山羊莫拉菌的基本生物学特性、致病性和耐药机制等尚不明确，因此，本试验对其基本生物学特性进行探究，以期对将来的临床防治提供帮助。

1 材料与方法

1.1 病料和试验动物 吉林市某养殖场的患病山羊，表现为精神沉郁、食欲减退、流黏性鼻液并伴有轻微咳嗽。昆明系4周龄SPF级小鼠20只，雌雄各半，体重为18～22 g。

1.2 培养基及试剂 BHI琼脂培养基、MH琼脂培养基、BHI肉汤培养基，均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；LB琼脂培养基、细菌基因组DNA提取试剂盒、50×TAE缓冲液，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PremixTaq(ExTaqversion)，购自TaKaRa Bio；微量生化管、药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；核酸染料、革兰染色试剂，均购自北京索莱宝科技有限公司；凝胶回收试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。16S rDNA上、下游引物，由库美生物科技有限公司合成。

1.3 细菌的分离培养 把采集的鼻拭子接种于BHI琼脂培养基上，37 ℃培养18～24 h。将接种环彻底灼烧灭菌后，挑取单个菌落在LB琼脂培养基上划线，置于37 ℃恒温箱中培养18～24 h，并将其命名为MC-1。

1.4 染色镜检 对载玻片用酒精消毒后，挑取单菌落用无菌生理盐水稀释，在酒精灯外焰加热固定，按照革兰染色说明书步骤进行染色，并于显微镜下观察。

1.5 生化试验 挑取纯化培养后的MC-1接种于微量生化鉴定管，37 ℃培养20～24 h，试验过程参照微量生化管说明书。

1.6 16S rDNA序列测定

1.6.1 基因组DNA的提取 取1.5 mL过夜培养菌液，严格按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书步骤提取基因组DNA。

1.6.2 PCR扩增 PCR反应体系(25 μL)：PremixTaq酶12.5 μL，去离子水9.5 μL，模板MC-1基因组、上游引物(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游引物(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，混合均匀。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6.3 PCR测序 PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，其切胶纯化产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.7 系统进化分析 分离菌株MC-1的16S rDNA测序结果与GenBank数据库中已知的不同种的细菌基因核酸进行BLAST比对分析，并参照相关菌株16S rDNA核酸序列构建系统进化树。

1.8 药敏试验 选用兽医临床上常用的14种抗菌药，采用纸片扩散法测定分离菌株MC-1的抑菌圈直径，分析其药物敏感性。

1.9 小鼠致病性试验 将小鼠随机分为4个组，每组5只，其中1个组作为对照组。取新鲜培养菌液，12 000 r/min离心10 min，弃上清，菌体沉淀用PBS重悬，调整菌液浓度为1×109CFU/mL。试验组小鼠腹腔注射重悬菌液0.2 mL/只，对照组腹腔注射相同剂量的PBS。接种后每隔6 h观察1次，连续观察5～7 d，期间观察并记录小鼠的精神状态、体表变化和死亡情况。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 将菌液接种于BHI琼脂培养基上，37 ℃需氧培养36 h后进行观察。发现该菌菌落较小，呈灰白色，菌落圆润，表面光滑有凸起，见图1。

图1 MC-1菌落形态Fig.1 Colony morphology of MC-1

2.2 染色镜检 对挑取的单个菌落进行革兰染色，在显微镜油镜下观察发现，菌株MC-1为革兰阴性杆菌，在视野内多数排列紧密，常上下组合在一起，见图2。

图2 MC-1革兰染色 (1 000×)Fig.2 Gram staining of MC-1 (1 000×)

2.3 生化试验 记录试验结果并参照《伯杰细菌鉴定手册》第8版进行分析。结果显示，MC-1氧化酶阳性，符合莫拉菌的性质。但MC-1可以发酵葡萄糖和蔗糖，这点与其他莫拉菌存在不同，见表1。

表1 MC-1生化试验结果Table 1 Results of MC-1 biochemical test

2.4 16S rDNA序列测定 分离菌株16S rDNA PCR扩增产物电泳结果显示，其扩增产物在1 500 bp左右，见图3。序列结果在GenBank数据库中经BLAST分析，显示该菌与莫拉菌的同源性为99.7%，证实分离菌株为莫拉菌。

图3 分离株16S rDNA的PCR 扩增Fig.3 PCR amplification of 16S rDNA gene from isolated strain M：DL2 000 DNA Marker； 1、2：MC-1 16S rDNA PCR扩增产物M:DL2 000 DNA Marker; 1,2:PCR product of MC-1 16S rDNA

2.5 系统进化分析 核苷酸测序结果在GenBank数据库中进行BLAST分析，与莫拉属其他种的16S rDNA序列建立进化树。结果显示，该分离菌株与Moraxellacaprae(登录号：NZ AUGF0100104.1)亲缘关系极近，再次证明MC-1为山羊莫拉菌，见图4。

图4 MC-1与其他莫拉菌16S rDNA系统进化树的构建Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene from MC-1 and other Morexella strains▲：本试验获得分离株▲：The isolates obtained in this test

2.6 药敏试验 采用纸片扩散法对MC-1进行药敏试验，并测定抑菌圈直径。分析药敏试验数据并参考相关研究，发现MC-1对试验中的14种抗菌药物均敏感，见表2。

表2 MC-1药敏试验结果Table 2 Results of MC-1 drug sensitivity test

2.7 小鼠致病性试验 试验组注射菌液约24 h后，部分小鼠出现精神沉郁、毛发蓬乱、打堆现象；48 h后随机选取精神不佳小鼠剖检，未发现典型病变症状；72 h内所有精神不佳小鼠恢复正常状态，试验阶段小鼠均未死亡。

3 讨论

本试验在采集的山羊鼻拭子样品中分离得到菌株MC-1，通过对其菌落及菌株的形态特征观察，并结合生化试验、16S rDNA序列测定和系统进化树分析，鉴定菌株MC-1为山羊莫拉菌。山羊莫拉菌是Kodjo等在健康山羊的鼻腔中分离的类莫拉菌，在进行了全基因组DNA-DNA杂交、DNA碱基组成和遗传转化研究后，将其归属于莫拉菌属[11]。莫拉菌属为无动力的杆菌或球杆菌，氧化阳性酶，对糖类不发酵，生化反应不活泼。过去认为莫拉菌属对人体无致病力，目前认为其对人体是机会致病菌，在机体防御功能不健全或免疫功能受到严重抑制时，其可单独或与其他细菌共同感染，引起脑膜炎、败血症、心内膜炎和胸脓等[12]。多篇报道显示，绝大多数莫拉菌对青霉素敏感，某些菌株对卡那霉素、青霉素、庆大霉素耐药[13]。

本试验中山羊莫拉菌菌株MC-1，通过小鼠致病试验发现其毒力较弱。从基本生物学特性来看，菌株MC-1与同属的其他莫拉菌存在明显的差异。生化试验中，传统莫拉菌对糖类不发酵，但本试验获得的山羊莫拉菌在葡萄糖、蔗糖的检测中呈阳性。镜检结果显示，本试验获得的山羊莫拉菌为杆菌，王江博[14]曾在文章中提到山羊莫拉菌为球菌。药敏试验结果显示，本试验获得的山羊莫拉菌对阿莫西林、四环素、多西环素、庆大霉素、阿奇霉素、氯霉素、头孢曲松、磺胺异噁唑等多种抗菌药物高度敏感。虽然山羊莫拉菌目前对多种抗菌药物敏感，但作为人体和哺乳动物呼吸道的常驻菌，在当今滥用抗菌药物导致耐药菌株不断增多的严峻形势下，不可忽视每一种潜在病原菌在抗菌药物压力下产生耐药性的能力。