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牦牛多杀性巴氏杆菌烈性噬菌体的生物学特性与全基因组序列分析

2022-08-06马凯茹闫艳新孙虎芝桂林生张红见任慧英

中国兽医杂志 2022年5期
关键词:出血性噬菌体效价

魏 歆 , 马凯茹 , 赵 猛 , 闫艳新 , 孙虎芝 , 潘 强 , 桂林生 , 张红见 , 任慧英 , 赵 静

(1.青海大学农牧学院 , 青海 西宁 810016 ; 2.青岛诺安百特生物技术有限公司 , 山东 青岛 266109 ;3.青岛农业大学动物医学院 , 山东 青岛 266109)

牦牛出血性败血症是由B型多杀性巴氏杆菌引起的青海省牦牛的一种常发病,该病可给畜牧业造成严重的经济损失[1]。王生祥等[2]研究表明该病发病率低,仅为2.85%,而致死率高,达52.31%。针对该病常使用疫苗和抗生素进行防控,但疫苗太过单一,抗体效价低,抗生素多重耐药现象严重[3],这给临床防治牦牛出血性败血症带来了巨大困难[4]。

噬菌体裂解率高,1个噬菌体颗粒只需经过4个裂解周期,便可以杀死约10亿个细菌[5],这一特性使噬菌体在治疗细菌性疾病方面显示出巨大的潜力[6-9]。本试验分离得到1株牦牛多杀性巴氏杆菌烈性噬菌体,通过对其进行生物学特性研究以及全基因组测序分析,旨在为其能否开发成一种防治牦牛出血性败血症的新型生物制剂的提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验所用菌株 多杀性巴氏杆菌S34由本实验室从患病牦牛肺脏分离;CVCC453等12株标准菌株,均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心;P0910系青海省祁连县牦牛源多杀性巴氏杆菌分离株,P0825系青海省同德县猪源多杀性巴氏杆菌分离株,P0903系青海省尖扎县藏羊源多杀性巴氏杆菌分离株,均由青海大学传染病实验室保存;C45-2系多杀性巴氏杆菌疫苗株,购自兰州兽医药品厂。

1.2 试剂及主要培养基 胰蛋白大豆琼脂(Tryptic soy agar,TSA)、胰蛋白大豆肉汤(Tryptic soy broth,TSB),均购自英国OXOID公司;新生犊牛血清,购自上海源叶生物科技有限公司;DNA提取试剂盒,购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.3 样品来源 从青海省黄南藏族自治州尖扎县龙知养殖场、金龙养殖合作社、万玛生态养殖社、康杨镇泰农养殖合作社以及3个牦牛散养农户共7个采样点,分别采集牦牛粪便和污水混合物500 mL,共计7份样品。

1.4 多杀性巴氏杆菌的复苏 将用甘油保存在-80 ℃的1.1中的菌株于TSA血清平板上分区划线,过夜培养,挑取单个菌落接种于5 mL含5%犊牛血清的TSB中,37 ℃、180 r/min振荡培养18 h至对数期备用。

1.5 多杀性巴氏杆菌噬菌体的分离纯化及效价测定 将粪便和污水混合物装入含有宿主菌和液体培养基的样品瓶中振摇培养,用双层平板法[10]检测有无噬菌斑并进行纯化。将纯化后的噬菌斑取斑浸出,取等量噬菌体和宿主菌加至含有5%犊牛血清的5 mL TSB中,37 ℃、180 r/min振荡培养,直到液体变澄清为止。将增殖好的噬菌体按10倍倍比稀释,双层平板法测定其效价,然后用甘油保存于-80 ℃冰箱中。

1.6 噬菌体透射电镜观察 取效价达到108~109PFU/mL的噬菌体增殖液,悬空滴加20 μL到铜网上,再在铜网上滴加15 μL的2%磷钨酸染料染色,用透射电镜观察该噬菌体的形态。

1.7 噬菌体热稳定性测定 各取500 μL的噬菌体增殖液分装于1.5 mL离心管中,分别置于50、60 ℃和70 ℃水浴中作用20、40 min和60 min,每个温度做3个重复。处理完毕后,立即放入冰箱中冷却,使用双层平板法测定其效价。

1.8 噬菌体pH测定 在3支试管中加入不同pH(4.0、5.0、6.0、9.0、10.0)的TSB 4.5 mL,再各加入500 μL噬菌体增殖液,混匀,37 ℃水浴作用1、2 h和3 h,然后加入适量1 mol/L的HCl或NaOH,使混合液的pH为7.0,按10倍倍比稀释到合适梯度,使用双层平板法测定噬菌体的效价,每组做3个重复。以作用时间为横坐标,噬菌体效价的对数值为纵坐标绘制pH曲线。

1.9 噬菌体最佳感染复数(MOI)测定 增殖多杀性巴氏杆菌噬菌体和宿主菌,将菌液和噬菌体浓度分别调整为1.0×108CFU/mL和1.0×109PFU/mL,保持菌液浓度不变,对噬菌体作系列稀释,取等量的菌液和噬菌体液混合,使噬菌体与宿主菌的比值为1、0.1、0.01、0.001、0.000 1和0.000 01,37 ℃、180 r/min振荡培养至液体变澄清,12 000 r/min离心5 min,取上清,测定噬菌体的滴度。

1.10 噬菌体裂解谱测定 采用点斑法[10]测定噬菌体裂解谱,取100 μL待测菌用无菌棉棒均匀涂在TSA上,待菌液充分吸收后,取1 μL噬菌体增殖液滴到涂好菌液的TSA血清平板上,置于37 ℃过夜培养。

1.11 噬菌体的一步生长曲线绘制 按参考文献[10]进行。

1.12 噬菌体Pa7全基因组测序及分析 按照DNA提取试剂盒中的说明书提取噬菌体DNA。采用Illumina 测序技术进行噬菌体的基因组扫描测序,构建Illumina PE文库。用SPAdes 软件完成基因组的拼接,用 GeneMarkS软件对新测序的基因组进行编码基因预测。将预测基因的蛋白序列分别与 Nr、COG、eggNOG、KEGG、Swissprot 和 GO 数据库进行BLAST比对(BLAST 2.2.30+,比对标准:E值不大于1e-5)。通过Blast2GO软件对BLAST结果进行GO 注释分析。使用在线工具tRNAscan-SE预测有无tRNA基因[11],用CGE server检测基因组的耐药基因,用MEGAX软件对噬菌体进行分子系统发育分析[12]。

2 结果

2.1 多杀性巴氏杆菌的分离纯化及效价测定 采用双层平板法从7份牦牛粪便和污水混合物中分离到1株裂解性噬菌体vB_PmuP_Pa7(简称Pa7),测定噬菌体的滴度为1.18×108PFU/mL。经培养纯化至4代后,平板上可见噬菌体形态呈圆形、透亮、边缘清晰,直径约2 mm,外围有一圈约1 mm的半透明光晕的噬菌斑,见图1。

图1 噬菌体Pa7的噬菌斑(第4代)Fig.1 Plaque of phage Pa7 (4th generation)

2.2 噬菌体透射电镜观察 纯化后的噬菌体经过磷钨酸染料染色后,在透射电镜下可见其头部为正廿多面体,直径约55 nm,还有一直径约20 nm的短尾,见图2。

图2 噬菌体Pa7电镜下的形态Fig.2 Morphology of phage Pa7 under transmission electron microscope

2.3 噬菌体热稳定性 经过各个温度梯度、不同时间条件下水浴处理后,噬菌体Pa7在50 ℃时,效价基本保持不变;在60 ℃和70 ℃作用20 min时,效价下降3个梯度;在60 ℃作用40 min 时,效价下降4个梯度;在60 ℃作用60 min和70 ℃作用40 min时,效价下降6个梯度;在70 ℃作用60 min时噬菌体基本失活,见图3。由此可知Pa7能耐受一定的高温,60 ℃以上不稳定。

图3 噬菌体Pa7热稳定性Fig.3 Thermal stability of phage Pa7

2.4 噬菌体pH 经过不同酸碱溶液处理后,结果显示噬菌体Pa7能够耐受一定的酸碱环境,在pH为5~9时其效价较为稳定,随着pH的进一步升高或降低,其活性显著下降,见图4。

图4 噬菌体Pa7 pH稳定性Fig.4 pH stability of phage Pa7

2.5 噬菌体最佳MOI 当MOI为0.01时,噬菌体Pa7的效价最高,此时滴度为2.83×108PFU/mL,由此可确定噬菌体Pa7的最佳MOI为0.01,见表1。

表1 噬菌体Pa7的最佳感染复数Table 1 Optimal MOI of phage Pa7

2.6 噬菌体裂解谱 采用点斑法测定噬菌体的裂解谱,结果显示Pa7仅对荚膜血清B型多杀性巴氏杆菌具有裂解性,对荚膜血清A型、D型、E型和F型的多杀性巴氏杆菌都不具有裂解性,表明该噬菌体具有高度的特异性,见表2。

表2 噬菌体Pa7的裂解谱范围Table 2 Range of lytic spectrum of phage Pa7

2.7 噬菌体的一步生长曲线 Pa7的潜伏期大约持续15 min,在感染后的20~120 min内,噬菌体的数量呈上升趋势,该阶段为噬菌体的爆发期,120 min后逐渐趋于平稳。根据裂解量的计算公式可以计算出噬菌体的裂解量为162 PFU/cell,见图5。

图5 噬菌体Pa7的一步生长曲线Fig.5 One-step growth curve of phage Pa7

2.8 噬菌体Pa7基因组测序结果分析 全基因组测序结果显示,Pa7基因组为双链DNA,基因组大小长度为37 402 bp,G+C含量为40.9%。Pa7基因组不含tRNA基因和耐药基因。该基因组含有41个开放阅读框(ORFs),其中已知编码功能蛋白的有21个,其余的20个ORFs被预测为假定蛋白(Hypothetical protein)。Pa7核酸总长度为34 527 bp,占全基因组的92.31%,平均长度达到842 bp,基因组显示出很高的基因密度,类似于其他有尾dsDNA噬菌体。全基因组序列已提交GenBank,登录号为MT902335,见表3。

表3 噬菌体Pa7的41个ORFs基因功能注释Table 3 Functional annotation of 41 ORFs genes of phage Pa7

2.9 基因组模式图 根据表3的结果,用IBS软件绘制噬菌体Pa7的基因组模式图。如图6所示,将噬菌体Pa7每个ORFs所行使的功能分为噬菌体的包装和结构蛋白模块:噬菌体DNA包装蛋白A等;噬菌体的裂解模块:噬菌体尾丝蛋白、N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、穴蛋白等;噬菌体代谢和调控模块:单链DNA结合蛋白、核酸内切酶Ⅰ、内肽酶等。

图6 噬菌体Pa7基因组模式Fig.6 Genome structure of phage Pa7

2.10 Pa7的全基因组比对及进化树分析 Pa7 Blastn比对分析结果显示,其与巴氏杆菌噬菌体PHB02、PHB01具有较高的同源性,其中与Pa7同源性最高的噬菌体为PHB02(GenBank登录号为NC_047831.1),具有97.56%的相似性以及99%的覆盖率,见图7。

图7 噬菌体Pa7与同源性噬菌体的基因组比对圈图Fig.7 Genomic alignment of phage Pa7 with homologous phages

选取较为保守的噬菌体蛋白序列即DNA聚合酶构建系统发育树,以分析Pa7与其他噬菌体之间的进化关系,见图8。

图8 噬菌体Pa7 DNA聚合酶(ORF18)氨基酸序列的进化树分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequence of phage Pa7 DNA polymerase (ORF18)▲:本试验分离株▲:The strain isolated in this experiment

3 讨论

牦牛出血性败血症给青海省养殖业和公共卫生带来了巨大的经济损失和安全隐患。由于其病原多重耐药现象严重且疫苗抗体效价低,导致牦牛出血性败血症屡年发生。本试验独辟蹊径,瞄准噬菌体对细菌特异、高效杀伤这一研究热点,从临床筛选获得了1株青海省地方血清型B型巴氏杆菌烈性噬菌体Pa7,为抗菌药物减量化研究提供了候选毒株。但要将Pa7作为临床治疗牦牛出血性败血症的生物制剂,还需要建立动物模型对其安全性、给药方式以及用量等进行进一步研究,以减少临床用药所带来的污染。

目前除了涉及A、D型多杀性巴氏杆菌噬菌体的研究外[13-14],国内外鲜有其他血清型噬菌体的报道。本试验分离到的Pa7只裂解B型多杀性巴氏杆菌,而对其他种无裂解活性,说明该噬菌体具有专一性;生物学特性研究表明,Pa7最适温度为50 ℃左右,60 ℃以上不稳定;最适pH为5.0~9.0,比孙二超[13]报道的猪多杀性巴氏杆菌噬菌体PHB02最适pH 3.0~9.0稍高,这有利于噬菌体在牦牛出血性败血症治疗中发挥抗菌作用。pH会影响噬菌体吸附蛋白和宿主菌受体的空间结构,它的高低则会影响噬菌体与宿主菌的结合[10]。在临床应用中,动物胃酸环境是制约口服噬菌体治疗效果的因素之一,有学者建议给动物饲喂饲料之后,再口服噬菌体制剂,可避免胃腔内低pH对噬菌体的影响[15]。

根据噬菌体Pa7的一步生长曲线可知,Pa7的潜伏期大约持续15 min,在感染后的20~120 min内,噬菌体的数量呈上升趋势,是该噬菌体的爆发期,120 min后逐渐趋于平稳,其裂解量为162 PFU/cell,相较Schatner等[11]报道的噬菌体的爆发量68 PFU/cell高很多,推测Pa7对牦牛多杀性巴氏杆菌的杀菌力较强,具有开发为防治牦牛出血性败血症新型环保生物制剂的潜力。

通过对Pa7进行全基因组测序,结合电镜观察,结果显示该噬菌体为有尾噬菌体目,短尾噬菌体科,T7-like噬菌体。其基因组含有41个ORFs,编码功能蛋白的有21个,主要涉及核苷酸代谢和复制、结构和包装以及细菌裂解。据分析其中由ORF11编码1个单链DNA结合蛋白,与耶尔森氏菌噬菌体Yep-phi的单链DNA结合蛋白具有44.67%的同源性,它可以激活DNA聚合酶和解旋酶[16];ORF23编码的1种核酸外切酶与大肠杆菌噬菌体P694的核酸外切酶有55.9%的同源性,可催化宿主细菌dsDNA水解成单核苷酸,它们均可能参与DNA的修复和重组[17];由ORF31编码的噬菌体尾丝蛋白与寡养单胞菌噬菌体IME15的尾丝蛋白同源性为62.97%,与大肠杆菌T7噬菌体的同源性为62.01%,噬菌体通过尾丝蛋白来识别宿主[17],在噬菌体自身增殖和感染中起着关键作用;ORF13编码的N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶属于第二类内溶素;ORF37编码的穴蛋白先在细菌细胞膜上造成大量的空隙,再由ORF13编码的N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶作为第二类内溶素,与穴蛋白形成一个完整的裂解路径,使缺乏信号肽的内溶素可以穿过细菌细胞膜,然后迅速裂解宿主菌并释放出大量的子代噬菌体,起着辅助内溶素裂解宿主菌的作用[18-19],为筛选出具有高效保护效果的候选噬菌体进行基因工程改造提供了思路。

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