熊去氧胆酸抗肝纤维化的网络药理学研究

王 妍，代书景,4，佟 雷，张景阳，石学魁

(1.牡丹江医学院病原生物学教研室；2. 牡丹江医学院药剂学教研室；3.牡丹江市第二人民医院肝胆外科，黑龙江 牡丹江 157011；4.新郑市人民医院检验科，河南 新郑 451100)

熊胆粉为熊科动物黑熊(Ursus thibetanus)或棕熊(Ursus arctos)的干燥胆汁，具有清热、平肝、明目的功能，现代研究证实具有保肝利胆、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等药理作用[1]。熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid,UDCA)是熊胆中游离型胆汁酸的主要成分之一，目前除蓝狐胆中含有一定量的UCDA、乌苏里貉貉胆含少量UCDA，其他动物胆汁尚未检测到UCDA[2]。动物实验显示，UDCA对大鼠免疫性肝纤维化有明显改善作用[3]；临床研究发现单纯熊去氧胆酸及与黄芪建中汤加减联合均能有效地改善自身免疫性肝炎患者的肝功能及肝纤维化[4]；体外实验研究证明UDCA可抑制人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)NIX蛋白的表达而发挥抗肝纤维化作用[5]。尽管UDCA临床应用广泛，但其确切作用机制尚未完全明确，故本研究拟采用网络药理学方法，分析UDCA抗肝纤维化的主要效应机制，为深入应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 UDCA靶点预测及注释登录PubChem服务器(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[6]，查询UDCA的3D分子结构式，下载3D分子结构并保存为图片格式(*.png)和SDF格式(*.sdf)文件。登录PharmMapper服务器(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)[7]，上传UDCA.sdf文件，获取与UDCA相对应的靶点蛋白。利用UniProt(https://www.uniprot.org/)数据库的Retrieve/ID Mapping工具[8]，对所预测的靶点蛋白进行检索，选择物种为“Homo sapiens”，将蛋白的UniProt ID转换为Gene Symbol，保存为UDCA的潜在靶点基因。

1.2 肝纤维化相关靶基因筛选以“liver fibrosis”和“hepatic fibrosis”作为检索词，分别通过GeneCards(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)数据库检索，删除重复基因，得到肝纤维化相关基因。

1.3 UDCA对肝纤维化作用靶基因的预测将UDCA相关基因和肝纤维化相关基因导入在线工具Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图，获得两者间共同基因，即为UDCA可能作用于肝纤维化的潜在靶基因。

1.4 “药物-靶点-疾病”可视化网络的构建将UDCA与肝纤维化共同靶点基因导入Cytoscape 3.7.2软件，构建UDCA作用于肝纤维化的“药物-靶点-疾病”的可视化网络图。

1.5 UDCA作用于肝纤维化的PPI网络构建及分析将UDCA作用于肝纤维化的靶点基因信息导入STRING数据库(http://string-db.org/)，设置物种为“Homo sapiens”，其余参数保持默认设置，隐藏游离节点，建立PPI网络并进行分析，根据节点连接数绘图，获得核心基因。

1.6 UDCA对肝纤维化作用靶点GO分析和KEGG分析对UDCA作用肝纤维化靶点基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，分析UDCA抗肝纤维化可能的功能及信号通路。

2 结果

2.1 UDCA相关作用靶点信息从PubChem 服务器上获取UDCA的3D结构(图1)，在PharmMapper服务器上得到靶点299个，经UniProt数据库注释，转换为Gene Symbol的基因为有效基因，共筛选出66个UDCA的潜在靶点基因。

图1 熊去氧胆酸3D结构

2.2 肝纤维化相关靶点筛选应用Gene Cards、OMIM数据库全面检索“liver fibrosis”和“hepatic fibrosis”，去除重复，共获得5576个肝纤维化相关基因。

2.3 UDCA作用于肝纤维化靶点的预测将UDCA相关靶点基因和Gene Cards、OMIM数据库中获取的肝纤维化相关靶点基因导入Venny 2.1.0在线工具，取交集，获得共同靶点基因35个，即为UDCA可能作用于肝纤维化的靶基因，得出韦恩图(图2)。

图2 UDCA与肝纤维化靶点基因交集的韦恩图

2.4 “药物-靶点-疾病”可视化网络的构建将筛选出的UDCA与肝纤维化共有的35个靶点基因导入Cytoscape软件，构建“药物-靶点-疾病”的可视化网络图(图3)，可以看出UDCA可通过对多靶点调控来发挥抗肝纤维化作用。

图3 “药物-靶点-疾病”的可视化网络图

2.5 UDCA作用于肝纤维化的PPI网络构建及分析将UDCA作用于肝纤维化的35个靶点基因导入STRING数据库获得靶蛋白相互作用关系，并得出各靶点蛋白间相互作用的网络图；剔除9个游离蛋白，共26个靶点蛋白参与了PPI网络(图4)。图中的每一个节点(node)表示一个蛋白，连线(edge)表示蛋白之间的相互关系，与邻接蛋白连线的数目越多，表示靶点蛋白在网络中发挥的作用越重要，计数每个靶点和其他靶点的连线数目并作图，得到连线≥3条的基因有8种，其中白蛋白(Albumin,ALB)的连线最多，为13条；雄激素受体(Androgen Receptor,AR)、基质金属蛋白酶2(Matrix Metallopeptidase2,MMP2)均为5条；热休克蛋白HSP90(Heat Shock Protein90 Alpha Family Class B Member 1,HSP90AB1)、过氧化物酶(Peroxiredoxin6,PRDX6)、小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1,RAC1)均为4条；埃兹蛋白(Ezrin,EZR)、核受体亚家族3C成员2(Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 2,NR3C2)均为3条(图5)。说明这些靶点可能在网络中发挥重要作用。

图4 蛋白互作网络图(PPI网络)

图5 PPI 网络核心靶点

2.6 GO分析和KEGG通路分析利用R软件[9]对UDCA作用于肝纤维化的35个靶基因进行GO富集分析，结果显示，生物学功能主要涉及GTP结合、嘌呤核糖核苷结合、嘌呤核苷结合、核糖核苷结合、鸟苷酸结合、泛素蛋白连接酶结合等(图6)。

图6 GO富集分析

对35个靶点基因进行KEGG通路富集分析，仅筛选出一条与UDCA抗肝纤维化密切相关的通路(P<0.05)：流体剪应力与动脉粥样硬化通路(图7)。

图7 流体剪切力与动脉粥样硬化通路

3 讨论

熊去氧胆酸单用或与其他药物合用对多种类型肝纤维化(酒精性、非酒精性、自身免疫性、血吸虫肝纤维化等)均有显著的防治作用[4,9-11]。但是，肝纤维化病因复杂，目前对于UDCA抗肝纤维化的作用机制研究尚不全面；而网络药理学注重从整体出发探索药物与疾病之间的关系，即“药物-基因-靶点-疾病”间复杂的网络关系，具有整体性、系统性的特点，因此本研究通过网络药理方法挖掘UDCA潜在作用靶点，对探究UDCA抗肝纤维化的作用机制有重要意义。

本研究通过PubChem服务器获取UDCA的3D结构，由PharmMapper服务器与Gene Cards、OMIM数据库预测UDCA抗肝纤维化相关靶点基因35个。通过STRING数据库分析，发现26个靶蛋白存在相互作用关系，其中ALB与邻接蛋白的连线是13条，说明ALB很可能是UDCA发挥作用的关键靶点；MMP2也在蛋白互作中起重要作用。较多的研究认为，肝纤维化由肝内ECM(细胞外基质)的过度沉积引起，MMP2(基质金属蛋白酶2)在ECM降解中起关键作用，扶正化瘀方可能通过调控MMP2基因表达而参与ECM的降解[12]；肝纤维化的发生也与ALB蛋白异常表达有关[13]，荔枝核总黄酮可通过干预ALB等的表达发挥抗肝纤维化作用和潜在保肝作用。因此，UDCA可能是通过调节相应作用靶点来发挥抗肝纤维化效果的。

通过“药物-靶点-疾病”的可视化网络图，显示UDCA可通过对多靶点调控来发挥抗肝纤维化作用。GO富集分析显示，这些靶点与GTP结合、嘌呤核糖核苷结合、泛素蛋白连接酶结合等功能有关。KEGG通路富集分析结果提示UDCA可能通过调整流体剪应力与动脉粥样硬化通路发挥抗肝纤维化作用。研究显示，肝星状细胞(HSC)的激活可持续产生大量ECM，促进肝纤维化发生、发展，而HSC又直接或间接受到血流动力学的影响发生相应的变化，即剪切应力的高低影响肝纤维化的发生[14]。UDCA具有中和活性氧毒性、利胆促进胆汁酸分泌、抑制线粒体损伤和保护肝细胞等作用，抑制肝纤维化的发展[7]。

综上所述，本研究应用网络药理学方法初步探究UDCA作用于肝纤维化的主要机制，为临床应用的有效性提供理论基础。由于本研究是基于网络平台、数据库所做的预测，研究结果具有一定的局限性，尚需进一步通过实验研究加以验证其有效性与可靠性。