基于网络药理学探讨清热活血方抗类风湿性关节炎的作用机制

柯丽青 成文翔 林结桃 陈建海 巩勋 姜泉 张鹏

摘要 目的：清熱活血在治疗类风湿性关节炎（RA）中效果显著，但其成分多样，作用机制不明，通过网络药理学方法探讨清热活血方抗RA的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选药物成分并利用SwissTargetPrediction数据库预测药物靶点，同时通过药物数据库（Drugbank）和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）收集疾病靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，拓展并拓扑获取关键靶点，利用DAVID数据库对关键靶点进行基因本体论（GO）分类富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，通过Centiscape计算获取hub节点。结果：从清热活血方中筛选出活性成分31个，预测靶点419个，数据库挖掘疾病靶点共430个。将药物靶点与疾病靶点取交集、拓扑分析获得清热活血方治疗类风湿性关节炎的关键靶点113个，GO分析共获得生物过程、分子功能、细胞组分共479个富集结果。KEGG富集表明清热活血方可能通过MAPK、Estrogen、PI3K-AKT、Thyroid hormone、Neurotrophin、HIF-1、ErbB、FoxO、B cell receptor等通路干预RA。拓扑得到CULI、EP300、HSP90AA1、TP53、HSPA8、CDC5L、UBC、RPS27A共8个干预RA的Hub节点。结论：清热活血方可能通过多靶点、多通路进行调控，达到治疗类风湿性关节炎的作用。

关键词 清热活血方;类风湿性关节炎;网络药理学;信号通路;作用机制;土茯苓;金银花;丹参

Abstract Objective：Qingre Huoxue Formula has significant effects in the treatment of rheumatoid arthritis，but its components are diverse and the mechanism of action is unknown.Therefore，the mechanism of Qingre Huoxue Formula′s anti-RA effect was explored through network pharmacology.Methods：The Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform （TCMSP） was used to screen drug components and used SwissTargetPrediction database to predict drug targets.Meanwhile，disease targets were collected through Drugbank and online human Mendelian genetic database （OMIM）.Intersect drug targets with disease targets，expand and topologically obtain key targets，use the DAVID database to carry out gene ontology （GO） taxonomic enrichment analysis and Kyoto gene and genome encyclopedia （KEGG） pathway enrichment analysis for key targets，and finally obtain hub targets through Centiscape calculation.Results：A total of 31 active ingredients were selected from Qingre Huoxue Formula，419 targets were predicted，and 430 disease targets were mined in the database.The key targets of Qingre Huoxue Formula for the treatment of rheumatoid arthritis were obtained by intersecting drug targets with disease targets and topological analysis.GO analysis obtained a total of 479 enrichment results of biological processes，molecular functions，and cellular components.KEGG enrichment indicated that Qingre Huoxue Formula may interfere with RA through MAPK，Estrogen，PI3K-AKT，Thyroid hormone，Neurotrophin，HIF-1，ErbB，FoxO，B cell receptor and other pathways.A total of 8 Hub nodes interfering with RA were obtained from the topology by CULI，EP300，HSP90AA1，TP53，HSPA8，CDC5L，UBC，and RPS27A.Conclusion：Qingre Huoxue Formula may play an anti-rheumatoid arthritis role by regulating multi-target and multi-pathway.

Keywords Qingre Huoxue Formula; Rheumatoid arthritis; Network pharmacology; Signal pathway; Mechanism of action; Smilacis Glabrae Rhixoma; Lonicerae Japonicae Flos; Radix Salviae

中图分类号：R285;R255.6;R593.22文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.005

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是常见的风湿免疫病，全世界发病率为0.5%～1.0%，造成严重的个人和社会负担[1]。目前常用非甾体抗炎药、糖皮质激素、甲氨蝶呤以及各类生物制剂等临床干预[2]，然而通常一种药物只针对单个因子或者某条信号通路，而RA这类复杂疾病需要多靶点组合治疗，随着现代中医药学研究的发展，选用疗效确切的中药已成为RA治疗用药的重要途径，前期临床观察表明清热活血方抗RA疗效显著且不良反应较少[3-4]，但其活性成分众多，作用机制不明，本研究基于网络药理学理念，辅助生物信息学手段，通过“药物-靶点-通路”方法预测清热活血方抗RA的潜在活性成分及作用机制，为深入机制研究及临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 筛选清热活血方活性成分 通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[5]对清热活血方中土茯苓、金银花、丹参等中药进行活性成分的检索，根据成分药动学吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数[6]进行筛选，其中口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，筛选出化合物并利用Pubchem获取其结构[7]。

1.2 预测清热活血方活性成分作用靶点并进行通路富集分析 以上结构导入SwissTargetPrediction数据库[8]，根据其结构预测药物可能存在的作用靶点，整合去重后进行京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析并利用Cytoscape对有效成分及其对应预测靶点进行可视化[9]。

1.3 检索RA发病靶点并挖掘清热活血方治疗RA的关键靶点 以“Rheumatoid arthritis”为关键词，检索药物数据库（Drugbank）[10]和在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM）[11]，获取已发现的RA发病机制相关靶点。将其与预测的药物作用靶点依次进行映射、扩展、拓扑[12]，得到清热活血方作用RA的关键靶点。

1.4 构建药物-疾病靶点蛋白质-蛋白质相互作用PPI网络 为验证清热活血方作用RA的关键靶点的挖掘准确性，将上述获取的关键靶点导入蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）数据库（String）[13]，选择最高置信度的数据，挖掘关键靶点的直接、间接调控关系，并据此构建靶点PPI网络。

1.5 关键靶点富集分析 将获取的关键靶点蛋白导入DAVID数据库，标识符选择“official_gene_symbol”，靶点背景和物种背景都选择“Homo Sapiens”，进行关键靶点的基因本体（Gene Ontology，GO）分析和KEGG分析，以此获取清热活血方治疗RA的关键靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

1.6 筛选Hub节点 为提高靶点的挖掘精确性，将已获取的关键靶点蛋白导入Centiscape，根据拓扑和生物学属性，应用“plot by centrality”找出高分靶点，即发生了强烈的相互作用的靶点蛋白。

2 结果

2.1 清热活血方活性成分 清热活血方根据OB和DL等ADME参数共筛选出49个化合物，再根据活性结构和预测靶点，共筛出31个有潜在靶点的活性成分（去重后的）。见表1。

2.2 预测清热活血方活性成分作用靶点并进行通路富集分析 对31个活性化合物进行靶点预测，剔重整合后共得到419个潜在靶点。将其预测关系导入Cytoscape软件构建化合物-靶点网络图（C-T图）。见图1。红色代表活性化合物，浅蓝色代表预测靶点。将活性成分作用靶点导入DAVID数据库进行KEGG分析，共富集出80条信号通路，按P值从小到大排序，P值越小越显著，把广泛通路剔除后筛选P值前10个，得到以下通路：HIF-1 signaling pathway、Nitrogen metabolism、Prolactin signaling pathway、Calcium signaling pathway、TNF signaling pathway、Type Ⅱ diabetes mellitus、Cholinergic synapse、Sphingolipid signaling pathway、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Acute myeloid leukemia、ErbB signaling pathway、PI3K-AKT signaling pathway、Rap1 signaling pathway、Arachidonic acid metabolism。

2.3 檢索RA发病靶点并挖掘清热活血方治疗RA的关键靶点 通过OMIM、Drugbank数据库检索、去重后共得到430个RA发病相关靶点。将药物预测靶点与疾病靶点进行映射、扩展、拓扑后得到113个关键靶点。

2.4 构建药物-疾病靶点PPI图 构建清热活血方与RA靶点蛋白的PPI网络图，共得到705条相互作用关系。见图2。节点代表RA靶点，边代表靶点间关系，不同颜色对应不同的相互作用类型。将上述111个存在相互作用的靶点与清热活血方预测靶点和RA靶点构建韦恩图分析。其中，14个靶点属于清热活血方预测靶点，5个靶点属于RA靶点。见图3。

2.5 GO富集与KEGG通路富集分析 将获取的关键靶点蛋白导入DAVID数据库进行GO分析和

KEGG分析，KEGG共富集出62条信号通路，按P值从小到大排序，P值越小越显著，把广泛通路剔除后筛选P值前15个，即得关键靶点基因的注释分类信息以及其参与的信号通路，其中大多数为RA发病密切相关通路。见图4。GO分析共获得479个富集结果，其中生物过程（Biological Process，BP）319项，分子功能（Molecular Function，MF）93项，细胞组分（Cellular Component，CC）67项，排名前15的GO富集结果见图5。

2.6 拓扑挖掘Hub节点 将已获取的关键靶点蛋白导入Cytoscape中的Centiscape，利用参数Betweenness中介性、Degree自由度等进行计算并作图，由此筛选出CULI，EP300，HSP90AA1，TP53，HSPA8，CDC5L，UBC，RPS27A共8个具显著作用的Hub节点，越靠近右上角的靶点越重要，提示这些Hub节点可能是清热活血方作用RA的重要靶点。见图6。

3 讨论

RA属于侵蚀性、自身免疫性疾病，有“不死的癌症”之称，严重影响患者的生命质量，其发病机制不明，涉及免疫反应、下游炎症细胞浸润、滑膜增生、血管翳形成和骨破坏等病理进程，现有治疗药物如DMARDs、NSAIDs等治疗靶点较为单一，多是延缓病理进程且不良反应较大[14]，通过多靶点调节免疫、抗炎、抑制滑膜血管翳增生、抗骨质疏松、保护软骨等联合治疗更为有效，逐渐引起了研究者们的注意[15]。

清热活血方具有清热利湿活血功效，前期临床观察表明此方剂对于RA具有明显的疗效[16]。而清热活血方内含多种有效成分，已被证实可通过阻断多种病理过程延缓RA进展：体内外研究表明山柰酚（kaempferol）能够通过多种途径抑制RA的发展[17-18]。槲皮素（quercetin）可明显降低炎症发病的严重性，并且干预后发病程度与TNF-α、IL-1β、IL-17和MCP-1水平的降低相关[19]。落新妇苷（Astilbin）与低剂量的甲氨蝶呤（MTX）联用能有效改善胶原诱导的DBA小鼠关节炎等[20]。清热活血方的C-T网络图表明，一种化合物具有多个靶点，符合RA多靶点的治疗需求，同时多种化合物作用于相同靶点，说明不同化合物间可发挥协同作用，增强干预疗效;而这些重合靶点可能是清热活血方干预RA的关键靶点。将419个化合物预测靶点进行KEGG分析，发现多数排名靠前的通路均与RA有关，如HIF-1 signaling pathway、PI3K-AKT signaling pathway、VEGF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、ErbB signaling pathway、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、TNF signaling pathway[21-22]，说明清热活血方可通过多通路达到治疗RA的目的。PPI网络靶点的韦恩图表明清热活血方可能通过直接或间接靶点共同作用于RA，其中属于清热活血方的有YWHAG、EGF、ABL1、HSPA8、SRC、CDK2、AKT1、ESR1、GAPDH、AR、VCP、APP PARP1、HSPA5，属于RA靶点的有SMURF1、FN1、TP53、EEF1A1，而同时属于清热活血方和RA的是HSPA5，表明清热活血方可能直接或者间接通过以上靶点干预RA。

传统中药复方具有多成分、多靶点、多通路、多功能的作用特点，本研究通过数据挖掘，分别获得RA发生相关基因430个及清热活血方有效成分预测靶点419个，进而整合出小复方抗RA药效相关靶点，建立小复方抗RA效应基因相互作用网络图，通过网络拓扑计算和功能挖掘，进一步印证小复方抗RA的关键候补靶点参与RA进展相关的“炎症-免疫”通路：如MAPK信号通路参与RA炎症细胞浸润和血管翳形成，阻断MAPK通路可有效降低RA动物模型炎症浸润和血管形成[23]。PI3K-AKT信号通路参与RA中成纤维滑膜细胞异常激活，并导致其过度增殖、迁移和侵袭[24]。在RA病理过程中，滑膜和血管内皮细胞周期失衡并过度增殖既是病理发展结果也加速了病理恶化进程[1]，通过调控细胞周期可能具有延缓RA进展的作用。B细胞通路在RA发病的起始阶段，促进炎症介质聚集以及破骨细胞活化过程中发挥了重要作用[25-26]。Hippo信号通路参与成纤维滑膜的侵袭表型[27]，在RA缺氧关节环境中，HIF-1信号通路促进滑膜血管翳增生、炎症反应及骨侵蚀等病理过程[28-29]，RA患者滑膜细胞中EGFR和HER2高表达，而通过干预HIF-1通路可能有助于RA的治疗[30]，此外，小复方抗RA的关键候选靶点还参与了细胞凋亡通路、黏着斑激酶途径、FoxO信号通路，这些通路都直接或者间接影响RA的进程。GO富集分析表明清热活血方可能通过调节转录过程、蛋白质异构化、细胞凋亡等BP过程干预RA，MF层面显示清热活血方抗RA可能与调节各种蛋白质结合、酶结合、核酸结合等途径相关;CC层面表明细胞核、核糖核蛋白复合物、细胞质、细胞核、核小体等细胞组分可能与清热活血方抗RA相关。

对关键靶点进行中心值的计算，筛选出8个Hub节点，有研究表明这些Hub节点与RA发病密切相关：其中HSP90AA1可阻断核因子κB通路，降低炎症介质水平，通过降低HSP90AA1表达水平可减轻滑膜炎症和关节软骨破坏[31]。TP53基因异常表达与RA炎症细胞浸润和滑膜组织异常增生以及骨與软骨的进行性破坏密切相关[32]。EP300抑制剂可降低RA并发症模型的指标[33-34]。进一步验证了本研究预测的准确性，这些靶点可能是清热活血方发挥抗RA作用的关键靶点。

RA是多因素影响、多基因相关、多条通路参与的复杂病理过程的，本研究表明，清热活血方中31个活性化合物通过113个有效靶点及其作用网络调控多条信号通路和生物学过程发挥抗RA作用，拓扑分析出有效靶点中的8个Hub节点，其中3个已被证明与RA相关，表明清热活血方其有效成分通过多靶点、多通路来发挥治疗RA的药效。从系统的角度初步揭示了清热活血方抗RA的作用机制，体现了中药多成分-多靶点-多途径的作用特点，一定程度反映了中医药治疗的整体观念，为后续阐述清热活血方功效的生物学内涵打下基础，同时也为针对发病机制复杂的RA治疗思路及开发新药物提供了方向。

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（2020-03-31收稿 責任编辑：王明）