高良姜素对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移和凋亡影响的机制研究

方 超，李婉玉，冯 晨，任春慧，毛艺纯，冯 华

(牡丹江医学院 1.病理生理学教研室；2.附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤之一，因其临床症状隐匿，80%患者就诊时已处于晚期。传统的治疗卵巢癌药物以化疗为主，包括铂类和紫杉醇等，但这些药物副作用较大，容易产生耐药性。近年来我国传统中草药用于卵巢癌的治疗一直受到学者们的关注，也是我国最富有自主创新特色的研究领域之一[2]。GLA是从我国传统中药高良姜中提取的专属成分，是一种天然的黄酮类化合物[3]。长期以来GLA一直用于治疗胃部疾病，近年来有多项研究表明GLA不仅具有抗炎、镇痛、抗氧化、降血脂等作用，而且在多种类型肿瘤中表现出了一定的抗癌活性[4]。细胞凋亡是一种公认的肿瘤抑制机制。在凋亡蛋白作用下，细胞凋亡程序可以有效地消除功能失调的细胞，维持细胞稳态。Bcl-2蛋白家族成员通过调控促凋亡因子和抗凋亡因子在细胞凋亡的过程中占据着核心地位。在细胞凋亡过程中，促凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2起着截然相反的作用，同样两者之间平衡也是决定细胞是否发生凋亡的关键所在。Bax会与Bad相互结合，以复合体形式来阻止Bcl-2，发挥促凋亡功能。而Bcl-2是Bcl-2蛋白家族的创始成员，它能够中和Bax和Bak，从而防止Bax的过度激活，抑制细胞凋亡。恶性肿瘤的发展过程一直以来与许多信号传导通路的异常活化密切相连。有研究表明在细胞受到外来刺激，作出应答效应过程中PI3K/AKT信号通路发挥着重要作用[5]。因此以PI3K/AKT信号通路为靶点的肿瘤治疗学一直是国内外学者关注热点之一。本研究以GLA为研究对象，旨在探讨GLA是否对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移以及凋亡能力产生影响，其作用机制是否是通过PI3K/AKT信号通路介导的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 GLA，相对分子量270.24(MW)，纯度>98%，购自上海阿拉丁生物科技有限公司。卵巢癌SKOV3细胞购自武汉procell公司；GAPDH、AKT、p-AKT、Bcl-2、和Bax抗体(万类生物，沈阳)；CCK8试剂盒(博士德，武汉)；TUNEL细胞凋亡试剂盒(碧云天，武汉)；流式凋亡检测试剂盒(万类生物，沈阳)。

1.1.2 仪器设备 多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)；荧光正置式生物显微镜(日本NiKon公司)；流式细胞仪(美国FACS Calibur公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将卵巢癌SKOV3细胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的McCoy′s 5A培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱培养，根据细胞生长情况，细胞每隔2～3 d传代一次。

1.2.2 CCK8法 以8×103个/孔的细胞密度培养于96孔培养板中过夜，每孔加入100 μL培养基，平行设置3个重复孔，用不同浓度梯度GLA(0 μmol/mL、1 μmol/mL、5 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、30μmol/mL、40 μmol/mL、50 μmol/mL、60 μmol/mL、70 μmol/mL、80 μmol/mL)作用于SKOV3细胞，向每孔中加入10 μL CCK8试剂，培养1～2 h。根据测定450 nm的OD值绘制细胞存活率的柱状图，细胞存活率(%)=[OD(实验组)-OD(空白对照组)]/[OD(正常对照组)-OD(空白对照组)]×100%。计算IC50值，IC50=1 g-1[Xm-i(∑p-0.5)]。选取细胞生存率>60%且数值较高浓度作为GLA给药浓度，用于后续实验。

1.2.3 细胞分组 取对数生长期细胞加入不同浓度GLA组，根据CCK8结果分为4个组：对照组，即0 μmol/mL GLA；10 μmol/mL GLA组；20 μmol/mL GLA组；40 μmol/mL GLA组。

1.2.4 细胞划痕实验 将SKOV3细胞以5×106个/孔细胞常规培养于6孔板中，当培养的细胞融合达到90%以上时，用200 μL移液器吸头尖端刮除细胞单层，每孔用PBS溶液冲洗漂浮细胞，分别加入不同浓度(0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL)的GLA，在无血清的培养基中培养。在倒置光学显微镜下，分别于0 h、24 h、48 h在40倍的放大倍数下拍照获得图片。

1.2.5 TUNEL实验 将SKOV3细胞接种于6孔板中，加入不同浓度GLA培养细胞24 h，用PBS冲洗，将细胞于4%的多聚甲醛在pH 7.4的NaH2PO4溶液中固定，PBS缓冲液洗涤细胞3次，3% H2O2孵育细胞5 min，在37 ℃避光情况下与TUNEL检测液混合孵育60 min，将细胞放入终止缓冲液孵育10 min，蒸馏水洗，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜(日本OLYMPUS)下观察阳性细胞数。

1.2.6 流式细胞术 卵巢癌SKOV3细胞以5×105个/孔分别加入0 μmol/mL、10 μmol/mL、20 μmol/mL和40 μmol/mL的GLA培养24 h，在膜联蛋白结合缓冲液中孵育细胞制备悬浮液，在室温避光5 min后，首先添加5 μL的Annexin V-FITC，再次添加10 μL的Propidium Iodide进行染色，用流式细胞仪分析凋亡细胞的百分比，实验重复3次。

1.2.7 Western Blot法 取卵巢癌SKOV3细胞接种于6 cm2的培养瓶中，孵育过夜后用不同浓度的GLA处理细胞24 h，加入RIPA裂解液(强)，在4 ℃、10000 r/min下离心20 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度，将等量的蛋白样品加入到12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离，转膜，用5% 脱脂奶粉对膜进行封闭，加入稀释的一抗Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶500)、p-AKT(1∶500)、AKT(1∶500)以及GAPDH(1∶500)，4 ℃冰箱孵育过夜。次日将过夜的一抗回收，加入TBST洗液，洗涤三次，加入按1∶5000稀释的二抗孵育1 h，然后洗涤，显影，实验重复3次。用Image J软件计算灰度值。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件，计量数据以“均数±标准差”来表示，采用t检验和单因素方差分析对不同组别的数据进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GLA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响CCK8法结果显示，GLA以剂量依赖性方式抑制卵巢癌细胞的生长(图1)，根据酶标仪测得450 nm的OD值计算GLA对SKOV3细胞的半数抑制浓度(IC50)约为49.77 μmol/mL。当GLA浓度达到50 μmol/mL时，SKOV3细胞存活率不足60%，故将GLA用药浓度分别设定为10 μmol/mL、20 μmol/mL、40 μmol/mL。

图1 不同浓度GLA对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

2.2 GLA对卵巢癌SKOV3细胞迁移的影响细胞划痕实验结果表明，在划痕24 h之后，与对照组相比，GLA组的细胞迁移率逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)；在划痕48 h之后，细胞迁移率显著减慢，效果比24 h更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈浓度依赖性(图2)。

2.3 GLA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响流式细胞术结果显示，与对照组相比，GLA组总体的凋亡细胞占比率分别为11.16%(10 μmol/mL组)、14.68%(20 μmol/mL组)和28.5%(40 μmol/mL组)(图3)，差异有统计学意义(P<0.05)。在TUNEL实验中，TUNEL染色细胞呈现绿色荧光，DAPI染色细胞呈现蓝色荧光，以TUNEL阳性细胞数与DAPI染色细胞总数之比表示凋亡率。结果显示，对照组的细胞凋亡率为6.29%，而GLA组凋亡细胞百分率却显著增加，分别是17.79%(10 μmol/mL组)、34.82%(20 μmol/mL组)和44.79%(40 μmol/mL组)(图4)，差异有统计学意义(P<0.05)。为了进一步阐明GLA诱导细胞凋亡的机制，应用Western Blot实验检测Bcl-2和Bax蛋白表达情况。与对照组相比，GLA组Bcl-2表达降低，而Bax表达升高，呈浓度依赖性(图5)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 GLA对卵巢癌SKOV3细胞迁移的影响

图3 流式细胞术检测GLA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

图4 TUNEL检测GLA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

图5 GLA对卵巢癌SKOV3细胞凋亡蛋白的影响

2.4 GLA对卵巢癌SKOV3细胞PI3K/AKT信号通路蛋白的影响应用Western Blot实验检测PI3K/

图6 GLA对卵巢癌SKOV3细胞PI3K/AKT信号通路蛋白的影响

AKT信号通路相关蛋白表达情况。结果显示，与对照组相比，GLA组AKT蛋白表达无显著性差异(P>0.05)，而p-AKT蛋白的表达显著下调。p-AKT/AKT的比率呈下降趋势，并且呈浓度依赖性(图6)，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

卵巢癌的死亡率一直高居妇科恶性肿瘤之首[6]。传统的卵巢癌治疗方案主要以手术为主，术后辅以化疗、放疗、内分泌治疗以及免疫治疗等[7]，虽然获得一定的疗效，但患者5年生存率并未显著提高，肿瘤细胞的转移、侵袭和对化疗药物产生的耐药性是造成其死亡率居高不下的主要原因。目前临床上主要缺乏对早期卵巢癌患者特异性诊断方法和行之有效的治疗药物[8]。因此寻找新的抗肿瘤药物，已成为目前攻克卵巢癌急需解决的关键问题。近年来，我国传统中草药在抗肿瘤机制研究史中一直受到国内外学者的关注。有学者发现传统中药GLA具有良好的抗肿瘤作用[9]。GLA的母核与抗肿瘤活性显著的细胞周期蛋白激酶抑制剂(Flavopiridol)类似。Flavopiridol是一种广泛的细胞周期蛋白激酶抑制剂，具有广泛的抗肿瘤活性[10]，目前已经进入了三期临床试验。有实验表明GLA能够通过促进结肠癌、肝癌以及乳腺癌细胞中的β连环蛋白降解来抑制β连环蛋白转录反应[11]。最新研究显示GLA能够抑制肝癌、肺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖[12]，是一种具有良好开发前景和应用价值的天然治疗药物。

PI3K/AKT信号传导通路活化与多种人类疾病有关，包括多种癌症和一些增生性疾病。PI3K/AKT信号通路最初被发现，是由于它可能会调节一定的细胞功能[13]。有研究表明PI3K/AKT信号传导通路在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、细胞周期进程、血管生成以及凋亡中发挥着重要作用[14]。有学者研究表明GLA通过阻断多种癌细胞的PI3K/AKT信号传导通路展现了强大的抗肿瘤活性[15]。汪俊剑等[16]研究表明GLA可抑制人肺癌细胞 A549 的增殖和侵袭，是潜在的肺癌治疗药物，其机制可能与调节相关基因蛋白水平以及抑制 PI3K 和 AKT 磷酸化有关。刘影等[15]研究探讨了GLA诱导人肝癌细胞 SMMC-7721 细胞凋亡时可能通过 PI3K/AKT 信号通路发挥作用。但是目前国内外文献报道中关于在卵巢癌中GLA作用于 PI3K/AKT信号通路的相关研究则鲜有报道。

本研究通过选取GLA作为研究对象，应用不同浓度的GLA作用于卵巢癌SKOV3细胞。CCK8结果显示GLA能够抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖活性，并呈一定的剂量依懒性。根据其450 nm测定的OD值，计算出IC50值为49.77 μmol/mL。肿瘤细胞的远处转移一直是卵巢癌复发的主要原因之一，并且发生了转移癌患者预后极差。通过划痕实验发现经过GLA处理后的卵巢癌SKOV3细胞向划痕区域移行减慢，其在划痕24 h和48 h的迁移率明显低于对照组。实验结果证明了GLA能够显著抑制卵巢癌SKVO3细胞的迁移能力，呈剂量依懒性。细胞凋亡一直以来与肿瘤细胞的发展密不可分[16]。Bcl-2家族蛋白在调节线粒体介导的凋亡途径中起着重要作用。Bax和Bcl-2是控制细胞凋亡的主要因素，Bax/Bcl-2活性水平之比是细胞凋亡敏感性的关键因素[17]。本研究应用流式细胞术和TUNEL实验检测出GLA能够诱导卵巢癌SKOV3细胞的凋亡，并呈现一定的剂量依赖性。Western Blot实验结果显示GLA处理的SKOV3细胞Bax蛋白表达量增加，Bcl-2蛋白的表达受到了抑制。PI3K/AKT信号传导通路与卵巢癌的发生发展密切相关，一直是众多学者研究的重点。在本研究中，GLA组AKT蛋白表达无显著性差异，而p-AKT蛋白的表达显著下调。p-AKT/AKT的比率呈下降趋势，呈浓度依赖性。结果表明GLA能够显著抑制PI3K/AKT信号通路激活，主要是通过调控PI3K/AKT蛋白磷酸化来发挥作用。

本研究尚存在一定局限性，目前只在一个卵巢癌细胞证明了GLA对卵巢癌的抑制作用，但在动物实验中还没有深入研究GLA的药理作用，并且在临床实验中GLA的使用效果还有待观察。大部分黄酮类化合物生物利用度是非常低的，它们在血浆和器官中很难达到抑制肿瘤细胞所需要的每毫升微摩尔数。可以在未来的研究中，GLA联合一些纳米乳剂和纳米脂质体，这样可以保证GLA的最大生物利用度。

综上所述，GLA可能通过调控PI3K/AKT信号通路来抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖和迁移，诱导细胞的凋亡。通过上述的实验结果有力地支持了GLA可以作为一种潜在的治疗卵巢癌辅助用药提供了理论依据。