白喉乌头对胶原诱导关节炎大鼠模型作用机制研究

张晨曦，葛 畅，丛 珊，王灵锐，文清慧，罗 剑，罗 莉

(新疆医科大学 1第一附属医院风湿免疫科，2第一临床医学院，乌鲁木齐 830054)

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其病理基础为侵蚀性滑膜炎症、骨和关节软骨进行性破坏，最终导致关节畸形功能障碍[1]。RA 全球发病率约为0.5%～1%，我国RA患者约有500 万人，其中女性患病率较高[2-3]。树突状细胞（Dendritic cells，DCs）、T 细胞介导的自身免疫活化异常在RA 的发生与发展中起着重要作用。DCs是体内抗原呈递能力最强的抗原提呈细胞（Antigen presenting cell，APC），具有诱导初始型T 淋巴细胞分化，激活免疫应答和诱导免疫耐受能力[4]。RA 患者滑膜组织中成熟的DCs呈高表达，可通过高表达的共刺激分子和MHC-II 分子诱导CD4＋T 细胞活化介导炎症反应[5]。因此抑制DCs 成熟，诱导免疫耐受可缓解RA 病情。 白喉乌头（Aconitum leucostomum Worosch.）是毛莨科乌头属的多年生草本植物产于新疆北部地区，常以根部入药，具有祛风除湿、温经止痛的功效[6]。单体1（Delvestidine）和单体4（氨茴酰牛扁碱）是白喉乌头发挥抗RA 作用的主要活性成分[7]。研究表明，白喉乌头能够减轻胶原诱导关节炎（Colla⁃gen induced arthritis，CIA）大鼠关节肿胀度，减少炎性细胞浸润，缓解CIA大鼠关节症状[8]，但其作用机制尚不明确。本研究通过建立CIA大鼠模型，分析检测白喉乌头对CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表达的影响，进一步探究白喉乌头治疗RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物60 只SPF 级雄性SD 大鼠，6～8 周龄，体重（200±20）g，购自新疆医科大学动物实验中心[动物许可证号：SYXK（新）2016-0001]。所有大鼠在23℃～25℃，55%～60%湿度环境中，保持正常昼夜节律，自由进食和饮水，适应性喂养1 周后进行后续实验。

1.2 试剂与仪器白喉乌头总生物碱（辰光生物科技公司，HA001011）、单体1：Delvestidine（辰光生物科技公司，HB001005）、单体4：氨茴酰牛扁碱（辰光生物科技公司，HA001017），雷公藤多苷片（远大医药黄石飞云制药公司，Z42021212），牛II型胶原（美国Chondrex公司，20022），完全弗氏佐剂（美国Sigma 公司，F5881），重组Anti-CD11c 抗体（美国abcam 公司，ab52632），Anti-MHC ClassII 抗体（美国abcam 公司，ab55152），ELISA 试剂盒（联科生物技术有限公司），酶标仪（美国Thermo 公司，VL0LA0D2），光学显微镜（日本OLYMPUS 公司，CX43），数显游标卡尺（日本Mitutoyo公司，500-180-30）。

1.3 方法

1.3.1 制备CIA 大鼠模型将2 mg/mL 的牛II 型胶原溶于0.05 mol/L 的冰乙酸中，得到终浓度为4 mg/mL的牛II 型胶原乙酸溶液，4℃过夜，充分溶解，加入等体积完全弗氏佐剂充分乳化[9]。于大鼠左足跖部、尾根部及皮背部皮下注射牛II 型胶原乳剂（0.3mL/只）进行初次免疫，1 周后，将上述胶原乳剂同部位进行加强免疫。

1.3.2 分组及干预措施将所有大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、阳性药组（雷公藤多苷组）、总生物碱组、单体1 组、单体4 组，每组各10 只，除正常组外，其余组大鼠建立CIA 大鼠模型，初次免疫3 周后（即加强免疫2周后），参照文献[10]进行灌胃，总生物碱组给予45 mg·kg-1·d-1的总生物碱灌胃，单体1组给予98 mg·kg-1·d-1的单体1 灌胃，单体4 组给予98 mg·kg-1·d-1的单体4灌胃，阳性药组给予1 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷片灌胃，正常组给予2 mL/d 的生理盐水灌胃，模型组给予2 mL/d 的生理盐水灌胃。药物干预剂量依据查阅白喉乌头毒理学资料及相关文献，通过半数致死量计算出适宜给药浓度[8,11]，且经预实验证实。

1.3.3 各组大鼠关节肿胀度、关节炎指数评分游标卡尺分别测量造模前后第3、4、5、6、7 周大鼠左后足踝关节直径，由2 名工作年限5 年以上，具有副研究员以上职称的专业动物实验人员同时测量，取两者平均值。关节肿胀度（%）=（给药后每周关节直径-造模前关节直径）/造模前关节直径×100%；关节炎指数评分（Arthritis index，AI）是评定CIA 大鼠模型造模成功与否的标准，AI评分标准[12]：无关节红肿为0 分，小趾关节轻度肿胀为1 分，趾骨关节及足趾红肿为2分，踝关节以下均红肿为3 分，包含踝关节在内的全部足趾肿胀为4 分。AI 评分≥6 分提示CIA 大鼠造模成功，分值越高代表致炎效果越充分，关节炎模型建立越成功。

1.3.4 组织病理学检测给药4周后处死所有大鼠，取各组大鼠踝关节，置于4%多聚甲醛溶液，固定24 h，置于10%EDTA 脱钙液中脱钙4 周，待针刺关节无阻力或阻力很小时，即完成脱钙。标本脱水浸蜡、包埋、切片，苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色，置于显微镜下观察踝关节滑膜病理形态（×100）。

1.3.5 ELISA 法检测血清炎症因子水平腹主动脉采集血液，室温静置20 min，待血液自然凝固，离心取上清液，根据ELISA 试剂盒说明书进行操作，分别检测各组大鼠血清炎症因子白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、肿瘤坏死因子-α（Tumor ne⁃crosis factor-α，TNF-α）的光密度（OD）值。

1.3.6 免疫荧光双重染色检测踝关节滑膜组织中DCs踝关节滑膜石蜡切片，烤片、脱蜡、抗原修复，加入0.3%牛血清蛋白，室温孵育，封闭30 min。于切片关节滑膜部位依次加入一抗，4℃孵育过夜，加入二抗，避光，37℃恒温箱内孵育30 min，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）荧光染液，孵育5 min，封片，置于荧光显微镜下观察（×200）。

1.4 统计学处理采用SPSS22.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠关节肿胀度、关节炎指数评分比较初次免疫第3 周，各组大鼠关节炎指数AI 评分≥6 分，CIA模型造模成功。灌胃4周后，与正常组大鼠比较，模型组大鼠关节肿胀度显著升高，AI 评分显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组、总生物碱组、单体1 组、单体4 组大鼠初次免疫后第6 周、第7 周关节肿胀度显著改善，AI 评分显著下降，差异具有统计学意义（P<0.01）（图1）。

图1 各组大鼠关节肿胀度、关节炎指数评分比较

2.2 各组大鼠踝关节组织病理学结果HE 染色结果显示，正常组大鼠滑膜细胞排列规则，表面光滑，关节滑膜边界清晰，无炎性细胞浸润，无血管增生；模型组大鼠滑膜细胞排列紊乱，层数明显增多，细胞间纤维结缔组织增生、水肿和有大量炎性细胞（单核细胞、多核细胞、淋巴细胞等）浸润，滑膜毛细血管增生，扩张的腔内充满红细胞；阳性药组、总生物碱组、单体1 组及单体4 组大鼠滑膜组织结构排列较模型组整齐，可见不同程度炎症细胞浸润，且均较模型组减少，可见少量毛细血管增生充血（图2）。

图2 各组大鼠踝关节组织病理学结果（×100）

2.3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 表达水平比较与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均显著升高，IL-4、IL-10 水平均显著下降（P<0.05～0.01）；与模型组比较，阳性药组、总生物碱组、单体1 组和单体4 组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均显著下降，IL-4、IL-10水平均显著升高（P<0.05～0.01）（图3）。

图3 各组大鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α表达水平比较

2.4 CD11c+DCs 表面MHC-II 分子在CIA 大鼠踝关节滑膜组织中的表达情况免疫荧光双重染色结果显示，与正常组比较，模型组大鼠中CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表达量明显升高（P<0.01）；与模型组比较，阳性药组、总生物碱组、单体4 组大鼠中CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表达量降低（P<0.05～0.01）。其中，总生物碱组、单体4 组大鼠CD11c+DCs表面MHC-II 分子表达量与阳性药组大鼠差异性较小，单体1 组大鼠CD11c+DCs 表面MHC-II 分子表达量较模型组大鼠降低，但差异无统计学意义（图4、表1）。

表1 各组大鼠CD11c+DCs表面MHC-II分子表达情况（±s，个/HPF）

表1 各组大鼠CD11c+DCs表面MHC-II分子表达情况（±s，个/HPF）

注：与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

组别正常组模型组阳性药组总生物碱组单体1组单体4组共定位双阳性细胞计数26.78±10.06 55.22±13.35##34.00±6.73**33.11±13.20**45.33±4.69 42.11±7.42*

图4 CD11c+DCs表面MHC-II分子在CIA大鼠关节滑膜组织中的表达情况

3 讨论

RA 是一种复杂免疫途径介导的慢性炎症性疾病，在RA 中DCs 调节T 细胞活化功能发挥着重要作用[13]。DCs 是目前发现机体功能最强的抗原呈递细胞，其基本功能是识别、摄取、处理加工及提呈抗原，并直接激活初始型CD4＋T 细胞刺激基础免疫应答，诱导辅助型T 细胞1（Th1）和辅助型T 细胞2（Th2）细胞分化。DCs 按照成熟活化状态可分为成熟DCs（mDCs）和未成熟DCs（imDCs），正常生理状态下大多DCs 处于未成熟状态，分布在外周组织和淋巴结中，具有强大的抗原摄取能力，维持外周免疫耐受。CD11c是DCs经典的标记分子，可表达于mDCs和im⁃DCs表面，本课题组前期研究表明，在RA患者关节液中CD11c+mDCs 聚集，关节液内成熟DCs 含量与RA患者疾病活动度、炎症反应呈正相关[14]，这表明RA患者关节炎症诱发DCs 成熟并使其聚集于炎症部位。李梦圆等[5]研究同样表明，RA 患者滑膜液中CD11c+mDCs 含量显著升高，分泌大量炎症因子诱发炎症反应。此外，免疫炎症状态下，抗原刺激imDCs迁移至炎症部位获得成熟表型，使mDCs 表面MHC-Ⅱ分子（DCs 成熟标记物）大量表达[15]，分泌促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 等，进一步促进DCs 成熟，增强其抗原递呈能力，激活机体免疫应答。同时，受IL-10等抑制因子的影响，mDCs能够抑制T细胞功能并介导免疫耐受[16]。因此通过抑制DCs 活化与成熟，影响T 细胞相关炎性因子释放是缓解关节炎症的有效途径。

本研究证实模型组大鼠关节滑膜组织中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子高表达，说明mDCs 在滑膜组织聚集诱发炎症反应。初次免疫第3 周开始灌胃给药4周后，总生物碱组、单体1组及单体4组大鼠关节滑膜组织中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表达量均下降，这与Wang 等[17]研究结果一致。提示白喉乌头能够降低CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表达，即下调mDCs 含量。同时本研究发现模型组大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 水平明显升高，IL-4、IL-10 水平明显下降，初次免疫第3 周开始灌胃给药4 周后，阳性药组、总生物碱组、单体1 组及单体4组大鼠血清中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著下降，IL-4、IL-10 水平显著升高。这提示灌胃给药后，滑膜组织中CD11c＋DCs 表面MHC-II 分子表达量下降，即mDCs 表达量降低，致使炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 释放减少，抑炎因子IL-4、IL-10 升高诱导免疫耐受。

综上所述，白喉乌头可能通过抑制CD11c+DCs表面MHC-II 分子表达，抑制DCs 分化与成熟，调节相关炎症因子的释放，改善CIA大鼠模型的关节症状及炎症，为白喉乌头缓解类风湿关节炎作用机制提供了实验依据。