整合素连接激酶在食管鳞状细胞癌中的表达和生物信息分析

刘 娟，魏 瑜，高 艳，曹雷雨，马晓丽，张 莉

（新疆医科大学第一附属医院综合内四科/特需内科，乌鲁木齐 830054）

食管癌发病率和死亡率分别占全球恶性肿瘤的第7 位和第6 位，而我国食管癌约占全球新发和死亡病例的43.0%和37.0%，主要以食管鳞状细胞癌（简称食管鳞癌）为主[1-2]。食管鳞癌早期症状不典型、恶性程度高、侵袭性强、缺乏早期诊断方法，其5年生存率仅为30%左右[3]。定量蛋白质组学技术及生物信息数据库的快速发展和完善，为探索食管鳞癌的发生发展及分子机制提供一定线索。整合素连接激酶（Integrin linked kinase，ILK）作为一种细胞内蛋白激酶，参与多种信号转导，调控细胞调亡、迁移、生长等生物学过程。在多种肿瘤中发现高表达的ILK 可介导调控细胞增殖、迁移和分化，并影响肿瘤的相关治疗效果[4-5]。本课题组已在细胞水平上验证了ILK 在食管鳞癌中的功能[6]，关于ILK促进肿瘤发生、发展的具体机制和其作用的下游靶点尚不清楚。本研究采用同位素标记相对和绝对定量法（Isobaric tag for rela⁃tive and absolute quantitation,iTRAQ）筛选出可能促进食管鳞癌发生发展的显著差异蛋白ILK，通过实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time PCR，qRTPCR）和蛋白免疫印迹（Western blot，WB）法进一步验证ILK 在食管鳞癌细胞及正常食管上皮细胞中的表达差异。在明确ILK 在食管鳞癌中高表达的基础上，利用生物信息技术，基于癌症基因组图谱（The can⁃cer genome atlas，TCGA）、基因型-组织表达研究项目（Genotype-tissue expression，GETx）数据库的基因测序结果，筛选出与ILK 表达密切相关的基因，并进行基因功能分类体系（Gene ontology，GO）、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and ge⁃nomes，KEGG）富集分析，以期找出可能存在的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2008年7月—2015年4月在新疆医科大学第一附属医院肿瘤科诊断为食管鳞癌的52例患者血液标本作为实验组。以同期年龄、性别相匹配的健康体检者26 例作为正常对照组。纳入标准：（1）病理活检明确诊断为食管鳞癌；（2）采血前未接受任何抗肿瘤治疗。排除标准：（1）其它部位恶性肿瘤病史者；（2）妊娠、哺乳期患者；（3）患有自身免疫性疾病或近期有感染病史者；（4）患有精神病史者。患者本人及委托人同意并签署《样本留取知情同意书》。本研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 样本采集、检测及差异蛋白筛选采集两组患者外周静脉血2 mL，离心，收集上清，置于-80℃冰箱备用。通过iTRAQ 技术筛选血清差异蛋白：（1）蛋白质提取；（2）蛋白质消化；（3）标记肽段；（4）HPLC（强阳离子交换色谱）及质谱检测；（5）蛋白质定性及定量分析。差异倍数>1.5 为显著上调，<0.6 为显著下调，均P<0.05。

1.3 细胞系食管鳞癌TE-1、KYSE150细胞和正常食管上皮SHEE 细胞均购自上海吉凯基因化学技术有限公司细胞保存中心。细胞置于含有1%双抗、10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基中，37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养。

1.4 qRT-PCR 法检测ILK 基因mRNA 相对表达水平采用Trizol法提取细胞中的RNA，通过逆转录试剂盒（TAKARA）两步法逆转录成cDNA。ILK引物序列如下：ILK-F:5'-GACGACATTTTCACTCAGTGC-3'；ILK-R: 5'-TCTGCTGAGCGTCTGTTTGTG-3'。 GAP⁃DH-F: 5'-ATCCCATCACCATCTTCCAGG-3'；GAP⁃DH-R:5'-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3'。采用Su⁃per Real PreMix Plus（SYBR Green）进行扩增，结果分析采用RQ=2-△△Ct进行计算。

1.5 Western blot 检测ILK 蛋白表达水平用含有相关蛋白酶抑制剂（PMSF、PIC）的通用型蛋白裂解液提取细胞总蛋白、BCA 蛋白定量，含有十二烷基硫酸钠（SDS）的Loading Buffer 100℃，10 min 高温变性、电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗4℃孵育过夜、加入二抗，室温孵育2 h、条带滴加超敏化学发光显色剂进行曝光显影，Image J 软件进行定量分析。

1.6 生物信息分析

1.6.1 ILK 在食管鳞癌中表达水平与生存分析运用UALCAN[7]（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）在线工具分析ILK 在TCGA 食管鳞癌数据库中的表达与预后相关性。

1.6.2 获取ILK 共表达基因 利用在线分析工具Linked Omics[8]（http://www.linkedomics.org/）分析并获取TCGA 数据库中在食管鳞癌中ILK 共表达基因，筛选条件设置为Spearman相关系数绝对值>0.5。

1.6.3 ILK 共表达基因的GO 和KEGG 富集分析将筛选出的ILK 共表达基因结果导入Cytoscape 软件，选用cluego 插件，从生物学过程（Biological process，BP）、细胞组成（Cellular component,CC）和分子功能（Molecular funtion，MF）等进行GO 分析和KEGG 信号通路富集分析，设置P<0.05。

1.6.4 筛选ILK 共表达核心基因（Hub gene）并构建相互作用网络图将筛选出的共表达基因输入String 进行分析，结果导入Cytoscape 软件，选用cytohubba 插件，根据节点度（Degree）筛选前10 位核心基因(Hub gene)，并构建蛋白质—蛋白质相互作用网络图（PPI）。

1.6.5 核心基因在食管鳞癌中表达情况利用TCGA和GTEx 数据库在线可视化数据分析网站GEPIA[9]（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析共表达核心基因在食管鳞癌中的表达情况并进行生存分析。

1.7 统计学处理采用SPSS23.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间差异蛋白比值、基因表达差异采用t检验，共表达基因间相关性采用Spearman分析，基因与生存预后相关采用Ka⁃plan-Meier分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌中ILK的表达

2.1.1 两组患者血清中差异蛋白筛选结果比较实验组与正常对照组血清比较，共筛选出46 个显著差异蛋白，其中上调蛋白26 个，如整合素连接蛋白激酶（ILK）、α1-酸性糖蛋白1（ORM1）、血清转铁蛋白（TF）等；下调蛋白20个，如血小板因子4（PF4）、半乳凝素-3-结合蛋白（LGALS3BP）等，见表1。

表1 两组血清对比部分显著血清差异蛋白

2.1.2 ILK 在食管鳞癌细胞及食管上皮细胞系中的表达情况食管鳞癌TE-1 和KYSE150 细胞中的ILK 蛋白相对表达量显著高于正常食管上皮SHEE细胞（P<0.05），见图1A；食管鳞癌TE-1 和KYSE150 细胞中ILK mRNA 相对表达量也显著高于正常食管上皮SHEE细胞（P<0.05），见图1B。

图1 食管鳞癌细胞和正常食管上皮细胞中ILK蛋白和mRNA相对表达情况

2.2 ILK 与食管鳞癌预后相关性分析UALCAN 工具分析结果显示，相同病理组织分化程度下，高表达的ILK 显著缩短食管鳞癌患者的总生存期，在病理分级同为Grade3时，两组间的差异最显著，见图2。

图2 ILK的表达水平与食管鳞癌患者预后分析

2.3 食管鳞癌中ILK 共表达基因的筛选结果Linked Omics 分析TCGA 数据集中食管鳞癌相关信息，获得ILK共表达基因175个，见图3。

图3 食管鳞癌中ILK共表达基因的筛选结果图

2.4 ILK共表达基因GO和KEGG分析GO分析结果显示，生物学过程主要富集于金属内肽酶抑制剂活化、负向调控新生血管中细胞迁移过程、负调控通路受限的SMAD蛋白磷酸化、膜蛋白外域蛋白水解的负调控、BMP信号通路的负调控等；细胞组成主要富集于细胞外基质、细胞骨架、内质网、黏着斑、肌动蛋白等；分子功能主要富集于整合素结合、生长因子结合、黏多糖结合、纤连蛋白结合等。KEGG分析结果显示，ILK共表达基因主要富集在细胞外基质受体相互作用、TGFβ信号通路、黏附、白细胞跨内皮迁移等，见图4。

图4 ILK共表达基因的GO和KEGG分析结果图

2.5 ILK共表达基因PPI网络构建及核心基因筛选结果筛选出节点度（Degree）前10 位的核心基因，即：纤连蛋白1(Fibronectin 1，FNl)、金属蛋白酶组织抑制因子1(Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP1)、结缔组织生长因子(Connective cissue growth factor，CTGF)、α-肌动蛋白-1(Actin alpha 1，ACTN1)、α-肌动蛋白-2(Actin alpha 2，ACTA2)、双糖链(Biglycan，BGN)、血小板反应蛋白1(Thrombospondin 1，THBS1)、整联蛋白α5(Integrin subunit alpha 5，ITGA5)、Ⅴ型胶原α1 链(Collagen type V alpha 1 chain，COL5A1)、钙黏合素2(Cadherin 2，CDH2)。将筛选出的核心基因导入Cytoscape 软件，构建核心基因蛋白互作网络分析（Protein-protein interaction，PPI），见图5。

图5 ILK共表达核心基因PPI网络图

2.6 核心基因验证结果GEPIA 分析结果显示，前10位核心基因中的FN1、TIMP1、CTGF、ACTN1、BGN、THBS1、COL5A1、CDH2 mRNA 表达水平在食管鳞癌组织中高表达(P<0.05）；ACTA2 mRNA 表达水平在食管鳞癌组织中呈低表达(P<0.05)；ITGA5 在食管鳞癌组织与正常组织中表达水平无差异(P>0.05），见图6A。筛选出的10个核心基因表达水平与食管鳞癌患者总生存时间长短均未见显著相关(P>0.05)，FN1、BGN 的高表达与患者无病生存期（Disease free surviv⁃al，DFS）减少显著相关(P<0.05)，THBS1、COL5A1的高表达与患者无病生存期减少有一定相关趋势，差异无统计学意义（P>0.05），见图6B。

图6 核心基因表达与生存分析结果图

3 讨论

ILK是一种在细胞内广泛表达含有3种结构域的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可与多种蛋白结合，参与细胞内多种信号转导通路，如整合素、生长因子、Wnt信号通路等，进一步调控细胞的增殖、分化、黏附、迁移、侵袭和肿瘤血管生成等[10]。有研究表明，ILK 蛋白在胃癌、食管癌组织中阳性表达水平显著高于癌旁组织，且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、临床分期等临床病理特征呈正相关[11-12]。目前大多数研究已证实ILK 的异常表达可促进肿瘤发生发展，并与患者生存预后和治疗效果欠佳相关[13-14]。研究发现ILK过表达可通过上调其转录因子Snail 来降低E-钙黏合素（E-cadherin）的含量，从而促进上皮间质转化（Epi⁃thelial-Mesenchymal transition，EMT）导致肿瘤细胞的侵袭和转移，而ILK 的表达沉默使得Snail、Twist、ZEB1 和β-catenin 的表达减少，逆转了“钙黏蛋白开关”[4,15-17]。ILK 可进行自我磷酸化，激活PI3K、Akt 信号通路，进一步发挥下游靶蛋白抗凋亡作用、影响细胞周期，促进细胞增殖等。Jia等[18]、Zeng等[19]均发现，ILK 可通过促进Akt 和mTOR 的磷酸化及VEGF 的表达，进而诱导间充质干细胞存活和肿瘤血管生成，从而促进肿瘤进程。因其结构和功能的复杂性，关于ILK转导信号通路的分子机制尚不清楚。

本研究采用iTRAQ 技术共鉴定出46个显著差异表达蛋白，其中整合素连接激酶(ILK)为显著上调蛋白，即ILK 在食管鳞癌患者血清中高表达。同时，qRT-PCR、Western blot 法验证食管鳞癌TE-1 和KYSE150 细胞中的ILK 相对表达量均显著高于正常食管上皮SHEE 细胞。这与李胜水等[11]在食管鳞癌患者组织中发现的结果相符。为进一步探索ILK 与食管癌的关系，利用UALCAN 工具分析ILK 在TCGA食管癌数据中的表达与预后的相关性，结果显示相同病理组织分化程度下，ILK 的表达水平越高预后越差。本研究利用肿瘤数据库对ILK 共表达相关基因集进行GO 和KEGG 富集分析，发现其共表达基因主要与细胞黏附、迁移等相关。联合String 数据库及Cytoscape 软件进行蛋白质之间相互作用分析筛选出10 个与ILK 共表达最紧密的Hub gene。GEPIA 分析结果显示，FN1、TIMP1、CTGF、ACTN1、BGN、THBS1、COL5A1、CDH2 mRNA 表达水平在食管鳞癌组织中呈高表达；而ACTA2 mRNA 表达水平在食管鳞癌组织中呈低表达；FN1 和BGN 高表达与患者DFS（无病生存期）减少明显相关。可推测ILK 在体内促进肿瘤的发生发展中可能伴随着上述基因的共同作用或改变。

综上所述，本研究通过对公共测序数据库进行生物信息学分析，提示ILK 在参与食管鳞癌的进程中，可能伴随或结合相应的共表达基因从而促进肿瘤的发生发展，这为后续研究ILK 在食管鳞癌中的机制研究提供一定的数据支持。