盐酸洛哌丁胺制备小鼠便秘模型的研究

李绿梅，张 娜，代瑶瑶，付 雪，王艳平，张莲香，孙向平

慢性便秘是临床常见的疾病或由于许多疾病而伴发的症状，或某些药物如阿片类药物的副作用所致,临床常用的治疗便秘药有药物依赖性或其他问题，不能从根本上解决便秘问题[1-2]。因此，研究便秘机制进而筛选有效的治疗药物成为当前研究的重点。针对不同原因导致的便秘所用的便秘模型不同[3-5]，对于阿片类药物所致便秘，多用盐酸洛哌丁胺制备便秘模型。盐酸洛哌丁胺为阿片受体激动剂，应用盐酸洛哌丁胺制备便秘模型可模拟临床使用阿片类药物导致便秘的机制研究[6-7]。文献报道用盐酸洛哌丁胺50 mg/kg灌胃7 d可制备稳定的小鼠便秘模型[7]，但本课题组参考此剂量制备便秘模型时成模率不高。课题组在文献报道的剂量的基础上进一步摸索盐酸洛哌丁胺制备便秘模型的最佳用药剂量和时间，为深入研究阿片类药物所致便秘的机制提供可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:本研究于2019年9月在宁夏颅脑疾病重点实验室完成。2月龄SPF级C57BL/6J小鼠，体重25 g，雌雄各半，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2005-0001，喂养于昼夜 12 h 交替、室温(24±2)℃环境中，自由进食水，在动物中转单元适应1周。本实验经学校伦理委员会批准。

1.1.2 器材和试剂：主要器材有小鼠灌胃针、电子天平电子秤(岛津电子天平UW220H，上海仪天科学仪器有限公司)，主要试剂有盐酸洛哌丁胺(2 mg/粒，国药准字：H10910085，西安杨森制药有限公司)和生理盐水(市售)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组:选取 50 只小鼠随机分为空白对照组和便秘模型组。便秘模型组根据盐酸洛哌丁胺剂量分为：50、60、70、80 mg/kg 4 个剂量组，每组10只。

1.2.2 给药方法:将盐酸洛哌丁胺溶于1 mL 纯水中，每天早、晚 7:00 灌胃给药，对照组给予等量纯水，持续7 d。

1.2.3 便秘效果观察:在小鼠灌胃期间每日称量小鼠体重和粪便重量，观察粪便性状、活动状态、毛发状态、存活情况。通过每天的排便量结合小肠推进情况判断成模情况。在造模成功后继续观察各组小鼠排便情况，确定模型的稳定性。

1.2.4 小肠推进试验:每组各选 4 只小鼠，造模完成后，小鼠禁食过夜以排空肠内容物，至第2 d上午开始进行小鼠肠道推进率检测。具体方法为：每只小鼠经口灌0.2 mL印度墨水，20 min用后异氟烷深麻醉小鼠再迅速打开腹腔，取出自幽门至肛门的全肠道，无张力拉直后测量肠道全长为L1；然后再测量墨汁在肠道内的行进长度为L2，计算小鼠肠道推进率：D=L2/L1×100%。

2 结果

2.1 便秘小鼠一般情况:各造模组小鼠给予不同剂量的盐酸洛哌丁胺后，观察小鼠活动度的变化。与空白对照组小鼠比较，50 mg/kg和60 mg/kg组小鼠活动度仅有轻微降低，差异无统计学意义；70 mg/kg组在给药第2～3 d 有轻度活动下降，之后明显下降；80 mg/kg组在第1～2 d 活动轻微下降，之后持续下降，至第5 d 不活动。在活动度变化中，便秘模型组以80 mg/kg组活动度最低，50 mg/kg组活动度最高。在7 d灌胃中观察小鼠的毛色，可见50 mg/kg和60 mg/kg组小鼠与空白对照组小鼠毛发均光滑有光泽，无明显差异；70mg/kg组和80 mg/kg组小鼠出现毛发光泽度差、毛杂乱、不光滑；各便秘模型组小鼠均进食减少，以80 mg/kg组进食降低更显著。在灌胃期间，80 mg/kg组小鼠因便秘严重而死亡2只，其他各组未出现死亡现象。

2.2 盐酸洛哌丁胺对小鼠体重的影响:各组小鼠在中转单元适应1周后，称量体重并记录。各组按照前述实验方案灌胃7 d，每天称量并记录各组小鼠体重。对各组小鼠体重进行统计，结果显示灌胃盐酸洛哌丁胺7 d对小鼠体重的影响不明显。

2.3 盐酸洛哌丁胺对小鼠粪便的影响:对各组小鼠每天的粪便性状进行观察并称重，在灌胃7 d中，空白对照组粪便性状和重量无明显变化。在灌胃2 d和3 d，与空白对照组比较，50 mg/kg组和60 mg/kg组粪便性状及量差异无统计学意义(P>0.05)；70 mg/kg组粪便性状差异无统计学意义(P<0.05)，便量减少；80 mg/kg组粪便较干，便量明显减少(P<0.05)；灌胃4、5、6及7 d，盐酸洛哌丁胺各剂量组粪便均较干，粪便重量均低于空白对照组(P<0.05)；且灌胃4 d时，70 mg/kg组和80 mg/kg组粪便重量低于50 mg/kg组和60 mg/kg组(P<0.05)；灌胃5 d，80 mg/kg组粪便重量低于50 mg/kg组和60 mg/kg组(P<0.05)，至灌胃6～7 d 盐酸洛哌丁胺各剂量组之间粪便重量差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明，70 mg/kg和80 mg/kg盐酸洛哌丁胺灌胃3 d可制备便秘模型，各剂量盐酸洛哌丁胺灌胃4 d时均可制备小鼠便秘模型，而且灌胃7 d时，各组便量和性状无显著差异，结果见图1(封三)，但80 mg/kg组小鼠腹胀明显，有2只死亡。

2.4 盐酸洛哌丁胺对对小鼠肠推进率的影响:按照盐酸洛哌丁胺的不同给药剂量，每组4只小鼠给药时间7 d，比较墨水在各组肠道的推进长度，并计算推荐率，验证造模效果。结果显示，盐酸洛哌丁胺各剂量组小鼠肠道推进率均降低，50 mg/kg剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；60 mg/kg、70 mg/kg和80 mg/kg组肠道推进率减低更显著(P<0.05)，见图2(封三)。

2.5 便秘效果观察:通过各组小鼠排便量、排便现状和小肠推进率判断，本研究盐酸洛哌丁胺各剂量均可成功制备便秘模型，但80 mg/kg组便秘症状严重(2只小鼠死亡)。为确定各剂量盐酸洛哌丁胺制备便秘模型的稳定性，在停止灌胃盐酸洛哌丁胺后，对各组小鼠的排便情况继续观察1周。结果表明，在停止灌胃 2 d时50 mg/kg组小鼠有2只排便正常，3 d时有1只排便正常；60 mg/kg组小鼠在停药5 d时有2只排便正常。研究结果表明，70 mg/kg可制备稳定的便秘模型。

3 讨论

阿片类制剂如吗啡、可待因等在临床有镇痛、镇咳、止泻、麻醉、解痉等作用，但如长期服用可诱发严重的胃肠道功能紊乱，进而导致便秘。研究发现，阿片类制剂的有效镇痛位点包括中枢神经系统和外周神经系统，阿片类诱发胃肠道功能紊乱则主要经激活外周阿片受体。相关文献报道[2]，阿片类诱发便秘的途径有以下两个：一是抑制肠蠕动，延缓肠道的输送功能；二是肠内容物在肠腔内滞留时间过长，抑制肠上皮细胞的分泌和增加黏膜层对水分的重吸收。因此，探索阿片类制剂抑制结肠运动的机制，寻找预防阿片类药物诱发便秘的药物，对临床扩大阿片类药物的使用范围具有重要的价值。

常用制作便秘模型的方法较多，阿片类药物致便秘机制常用盐酸洛哌丁胺制备便秘模型进行研究[6-7]。盐酸洛哌丁胺是阿片受体激动剂，为制备便秘模型的常用药物，相关文献报道用盐酸洛哌丁胺50 mg/kg灌胃7 d可制备稳定的小鼠慢性传输型便秘模型[7]，但本课题组参考此剂量制备便秘模型时成模率不高。因此，在参考文献剂量的基础上进一步摸索盐酸洛哌丁胺制备制作便秘模型的最佳用药剂量和时间，为深入研究阿片类药物所致便秘的机制提供可靠的动物模型。本研究分别用50、60、70和80 mg/kg 4个剂量的盐酸洛哌丁胺灌胃7 d，通过观察分析小鼠的一般情况、活动度、进食情况、体重变化、排便以及肠推进率情况来评价便秘模型的成模效果。研究结果显示，盐酸洛哌丁胺各剂量都可使小鼠便秘，但综合分析小鼠便秘效果，50 mg/kg组和60 mg/kg组有轻微便秘，停药后几天大便会较快恢复正常，而70 mg/kg组每天早晚各一次共灌胃7 d，制备的便秘模型最为稳定。本研究用50 mg/kg盐酸洛哌丁胺制备小鼠便秘模型的效果与姚一博等制备的模型效果有差异[7]，分析可能与小鼠的种属、饲养环境、个体对药物的敏感性、灌胃操作熟练程度等因素有关，也可能与稀释盐酸洛哌丁胺的液体有关；本研究用纯净水稀释溶解盐酸洛哌丁胺，而姚一博等用生理盐水溶解。另外，姚一博等分别用0.5、5和50 mg/kg 3个剂量研究制备便秘模型的最佳剂量和时间，3个剂量之间是十倍、百倍的差距，剂量差太大。本研究在文献报道的最佳剂量50 mg/kg基础上，增加了60、70、80 mg/kg 3个剂量，进而寻找更合适的剂量和时间，通过小鼠一般情况观察、粪便形态、重量、小鼠体重、墨水在肠道的推进率等指标评价造模效果，结果表明70 mg/kg组早晚各灌胃一次，连续灌胃7 d，可制备稳定的小鼠便秘模型，为进一步研究阿片类药物所致便秘机制与模型制备提供了参考依据。