高糖高脂环境下尿石素A对MIN6胰岛β细胞形态活力影响及分子机制初探

张之，祖丽胡马·热合曼，董怀洋

（新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830017)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是由胰岛素分泌缺陷或胰岛素抵抗导致的，以长期高血糖为特征的，由环境因素和遗传因素共同作用引起的代谢紊乱性疾病[1-2]。分泌胰岛素的胰岛β 细胞损伤是糖尿病发生发展的重要起因[3-4]。胰岛β细胞在高糖、高脂作用下易出现凋亡坏死，使血糖进一步升高，形成恶性循环[5]。因此寻找抵抗糖毒性、脂毒性保护胰岛β 细胞的天然药物成为现代医学研究的热点。尿石素A（Urolithin A，UA）是鞣花酸在肠道菌群作用下的代谢产物，该活性成分入血后发挥多种药理活性[6]。据报道，尿石素A具有抗衰老、抗炎、抗糖尿病作用[7]，可改善糖尿病模型小鼠肝组织胰岛素信号通路，促进Akt磷酸化和Glut2 蛋白的表达，促进葡萄糖转运入肝细胞[8]。UA 已被证实[9]是靶向PI3K/AKT/mTOR 信号通路改善胰腺癌的一种有前途的治疗方法。但尿石素A 对高糖、高脂环境下胰岛β 细胞形态活力的影响缺乏详细研究，对糖尿病关键靶点蛋白AMPK 、AKT、mTOR 是否有直接结合能力尚未见报道。本研究采用高糖、高脂损伤的MIN6胰岛β细胞模型，探究尿石素A 对MIN6胰岛β 细胞形态活力的影响及其作用的剂量、时间依赖性，通过分子对接方法预测UA 对上述糖尿病重要靶点蛋白的直接结合力，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器倒置显微镜（美国Thermo 公司）；Multiskan GO伯乐全波长酶标仪（赛默飞世尔仪器公司）。

1.2 试药细胞活力试剂盒-8 (CCK-8)（上海碧云天生物技术有限公司）；UA（湖北齐飞医药化工，批号：FT19120401）；DMEM 培养基（Dulbecco's modified ea⁃gle medium,美国HyClone公司）。

1.3 细胞培养与模型建立

1.3.1 细胞培养取小鼠MIN6胰岛β细胞置于含10%胎牛血清、青霉素100 mol/mL、链霉素100 μg/mL 和1%β-巯基乙醇的DMEM 培养液中，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养、贴壁、传代，备用。

1.3.2 建立模型取对数生长期的MIN6 胰岛β 细胞，调整浓度为5×104个/mL，接种于96 孔板，用含25 mmol/L 高糖DMEM 培养液分别诱导12、24、48、72 h，建立糖毒性不同诱导时间的MIN6胰岛β细胞损伤模型。用含0.5 mmol/L 棕榈酸的DMEM 培养液分别诱导12、24、48、72 h，建立脂毒性不同诱导时间的MIN6胰岛β 细胞损伤模型。用含25 mmol/L 葡萄糖和含0.5 mmol/L 棕榈酸的DMEM 培养液分别诱导12、24、48、72 h，建立高糖高脂毒性不同诱导时间的MIN6胰岛β细胞损伤模型。

1.4 细胞分组与给药取对数生长期的MIN6 胰岛β细胞，调整浓度为5×104个/mL，接种于96 孔板。以24 h 为诱导时间分别建立的高糖、高脂、高糖高脂3种模型，将细胞分为正常组、高糖模型组、高脂模型组、高糖高脂模型组、UA 组（按照1.4、2.9、5.8、11.5 和23.0 μg/mL 5 个浓度进行UA 药物干预），选出UA（11.5 μg/mL）组，在不同诱导时间12、24、48、72 h 建立3种模型，观察UA 干预不同时间的药效，分为正常组、高糖模型组、高脂模型组、高糖高脂模型组、高糖+UA 组，高脂+UA 组，高糖高脂+UA 组。正常组用含葡萄糖5.5 mmol/L 的DMEM 培养液培养；3 种模型组中葡萄糖或/和棕榈酸浓度见“1.3.2”，每组均设3个复孔。

1.5 细胞形态观察取生长状态良好、细胞贴壁长满瓶底的对数生长期MIN6 胰岛β 细胞，用完全培养基制备成5×104个/mL 单细胞悬液，接种于96 孔板中（100 μL/孔，即每孔5×103个细胞），37℃，5%CO2培养24 h 贴壁后按“1.4”项下细胞分组进行药物干预，每组5 个复孔，在培养箱中孵育36 h，倒置相差显微镜下（×100）观察细胞形态并拍照。

1.6 MIN6 细胞活力检测按“1.4”项下细胞分组处理后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，在培养箱内避光孵育4 h，采用酶标仪波长492 nm测定各孔光密度（OD）值，计算细胞活力，细胞活力/%=（OD实验-OD空白）/（OD正常-OD空白）×100%。

1.7 UA 与核心靶点分子对接从PDB 数据（https://www.rcsb.org/）下载度值最大的蛋白激酶B（AKT）、哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的3D 结构（*PDB 格式），从PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取化合物的2D结构（*sdf 格式），利用Pymol 软件对上述受体蛋白进行去水、去有机小分子配体等操作。 采用AutoDock4.2.6 对接软件对核心化合物配体和受体进行加氢、加电子并分别保存为*PDBQT 格式。运行Vina 对接，受体为刚性大分子，配体为柔性小分子，计算活性化合物与靶点蛋白的最优结合能。

1.8 统计学处理采用SPSS 22.0 统计学软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 7软件绘图，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，方差齐组间比较采用单因素ANOVA 分析，方差不齐采用非参数检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 UA 对高糖、高脂、高糖高脂环境下MIN6 胰岛β细胞形态的影响正常组MIN6胰岛β细胞形态正常，粘附良好，呈不规则长尾梭形或瓦片状，边缘清晰；高糖、高脂或高糖脂模型组细胞大部分长尾和角不可见或缩成团，黏附性降低，可见大量悬浮细胞和细胞碎片，细胞数量减少；UA 组细胞黏附性有显著恢复，大部分细胞重新长出长尾和角，悬浮细胞和细胞碎片明显减少，见图1-3。

图1 UA对高糖环境下MIN6胰岛β细胞形态的影响

2.2 不同浓度UA对糖脂毒性损伤的MIN6胰岛β细胞活力影响与正常组比较，高糖模型组干预24 h 后细胞活力降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与高糖模型组比较，UA（23.0 μg/mL）组干预24 h 后细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与正常组比较，高脂模型组干预24 h 后细胞活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与高脂模型组比较，UA（5.8、11.5 μg/mL）组干预24 h 细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与正常组比较，高糖高脂模型组干预24 h 后细胞活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与高糖高脂模型组比较，UA（1.4、2.9 μg/mL）组干预24 h 后细胞活力异无统计学意义（P>0.05），UA（5.8、11.5、23.0 μg/mL）组干预24 h后细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

图2 UA对高脂环境下MIN6胰岛β细胞形态的影响

图3 UA对高糖高脂环境下MIN6细胞形态的影响

表1 UA不同浓度干预对糖脂毒性损伤的MIN6胰岛β细胞活力影响（±s,n=3）

表1 UA不同浓度干预对糖脂毒性损伤的MIN6胰岛β细胞活力影响（±s,n=3）

注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较,#P<0.05, ##P<0.01。

细胞活力/%组别剂量/（μg/mL）正常组模型组UA组高糖高脂环境99.98±1.92 48.21±3.04**46.85±4.09 53.33±2.74 59.87±4.49##68.32±2.87##59.25±3.02##--1.4 2.9 5.8 11.5 23.0高糖环境99.97±3.27 58.40±2.81**64.41±4.66 63.15±2.68 58.09±3.52 62.52±2.76 72.50±4.30##高脂环境99.96±3.12 50.80±4.22**55.28±2.54 54.64±3.50 60.73±3.37##68.16±2.93##58.94±2.99

2.3 UA 干预不同时间对糖脂毒性损伤MIN6 胰岛β细胞活力的影响与正常组比较，高糖模型组干预12 h 后细胞活力差异无统计学意义（P>0.05），高糖模型组干预24、48、72 h 后细胞活力显著降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与高糖模型组比较，高糖＋UA组干预12、24、48、72 h 后细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）。与正常组比较，高脂模型组干预12、24、48、72 h 后细胞活力显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）；与高脂模型组比较，高脂＋UA 组干预24 h 后细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与正常组比较，高糖高脂模型组干预12、24、48、72 h 后细胞活力显著下降，差异有统计学意义（P<0.01）；与高糖高脂模型组比较，高糖高脂+UA 组干预12、72 h后细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）；高糖高脂+UA组干预24、48 h后细胞活力显著增加，差异有统计学意义（P<0.01），见表2。

表2 UA干预不同时间对糖脂毒性损伤的MIN6胰岛β细胞活力影响（±s,n=3）

表2 UA干预不同时间对糖脂毒性损伤的MIN6胰岛β细胞活力影响（±s,n=3）

注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与相对应的模型组比较,#P<0.05, ##P<0.01。

细胞活力/%组别正常组高糖模型组高糖+UA组高脂模型组高脂+UA组高糖高脂模型组高糖高脂+UA组72 h 99.99±6.33 16.75±1.03**18.39±1.43 13.07±1.81**17.51±0.92 10.02±1.23**15.61±1.44 12 h 99.99±6.61 93.81±5.09 100.73±5.08 73.15±3.52**77.17±2.40 82.63±4.19**84.37±3.62 24 h 100.00±3.82 51.45±3.55**52.12±2.82 49.34±2.35**58.66±2.34##42.55±3.67**60.31±2.36##48 h 99.99±2.46 27.70±2.59**28.56±1.99 27.01±1.79**30.57±2.27 24.16±0.84**32.32±2.32##

2.4 UA 与核心靶点进行分子对接对接评分均高于6，说明UA 与AKT、mTOR、AMPK 这些糖尿病核心靶点均具有良好的直接结合活性，见表3、图4。

表3 UA与糖尿病靶点蛋白对接结果

图4 UA与糖尿病核心靶点蛋白AKT1、mTOR、AMPK亚基对接图

3 讨论

高血糖和高血脂在糖尿病的发生、发展过程中扮演着非常重要的作用，可引起糖毒性、脂毒性反应[10]，使得胰岛β 细胞受到损伤，增加胰岛β 细胞的凋亡，降低胰岛β 细胞胰岛素的分泌，引起胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗又加重高血糖症[11]。脂毒性是指血液中的游离脂肪酸含量超过脂肪组织的贮存能力，而各组织对游离脂肪酸的氧化能力降低，结果过剩的游离脂肪酸在非脂肪组织中以甘油三酯的形式沉积，导致胰岛β 细胞的凋亡和损伤[12]。Toney 等[13]研究证明UA 通过增强线粒体功能和生物合成来改善胰岛素抵抗，并减轻肝脏中TG的积累，加强巨噬细胞中M1/M2 极化。Tuohetaerbaike 等[14]利用2 型糖尿病小鼠模型研究UA 的抗糖尿病作用，结果表明UA 能显著降低血糖血脂，并通过诱导自噬及调节AKT/mTOR信号通路发挥对糖尿病小鼠的胰腺保护作用。

本研究结果显示，与正常MIN6胰岛β细胞比较，单独高糖、单独高脂或高糖联合高脂环境下MIN6 胰岛β细胞损伤明显：细胞碎片化、细胞皱缩、细胞数量明显减少。MIN6胰岛β 细胞对单独高脂毒性比单独高糖毒性更敏感，高糖干预12 h MIN6 胰岛β 细胞活力下降不明显，而高脂干预12 h 的MIN6 胰岛β 细胞活力显著下降为原来的70%左右。随着高糖或棕榈酸干预时间延长，MIN6 胰岛β 细胞活力呈现时间依赖性逐步下降，高糖干预72 h MIN6 细胞活力下降为正常组的16%左右，高脂干预72 h,MIN6 细胞活力下降为正常组的13%左右，高糖联合高脂作用72 h,MIN6 胰岛β 细胞活力显著下降为原来的10%左右,显示出高糖高脂对MIN6胰岛β细胞的协同毒性。实验发现尿石素A 干预显著降低MIN6 胰岛β 细胞损伤，改善细胞活力，尤其在高糖高脂环境下保护作用更显著。课题组前期研究证明了尿石素A 对糖尿病小鼠胰腺的保护作用[15-16]，本实验从体外进一步证明了尿石素A 对胰岛β 细胞的保护作用。进一步的分子DOCK 分析显示尿石素A 药物分子对蛋白AKT、mTOR、AMPK 有良好的结合能，揭示其保护胰岛β 细胞的机制可能与直接靶向结合作用于糖尿病重要靶点蛋白AMPK、AKT、mTOR有关。