20β-羟基黄体酮的制备及孕激素样作用研究

闫淑静，陈春丽，谢湘云，高晓黎,2

（1新疆医科大学药学院，2新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830017）

黄体酮（P4）是一种由肾上腺皮质、性腺、中枢神经系统和外周神经系统分泌的类固醇激素[1-2]，是临床上用于黄体支持和绝经激素治疗的首选天然孕激素[3-4]，但由于其溶解度低且口服后具有显著的首过效应[5]，生物利用度低，临床应用受限[6]。口服P4后机体可产生多种代谢产物，其中代谢产物20α-羟基黄体酮（20α-DHP）具有P4 样作用（药效约为P4 的25%～50%）[7]，在调节排卵和促性腺激素的分泌，影响卵巢-垂体-下丘脑的交互作用中发挥重要作用[8]。20β-羟基黄体酮（20β-DHP）和20α-DHP 互为同分异构体，但目前对于20β-DHP的作用鲜有研究报道，本研究探究20β-DHP对原代培养的大鼠子宫内膜基质细胞（Rat endometrial stromal cell, RESC）增殖的影响，及其对RESC中孕酮受体（PR）和增殖细胞核抗原（PCNA）基因表达的调节，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器LC-6AD 半制备高效液相色谱仪、LC-20AT高效液相色谱仪、DAD二极管阵列检测器（日本岛津公司），AB-135S 电子分析天平（德国梅特勒-托利多公司），CTR6000 倒置荧光显微镜（德国Leica 公司），Multiskan GO 全波长酶标仪（美国ThermoFisher公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Ther⁃moFisher公司），QuantStudio6 Flex 实时荧光定量PCR仪（美国Abi 公司），H1-16KR 台式高速冷冻离心机（湖南可成仪器设备有限公司）。

1.2 试剂20α-DHP 对照品（加拿大多伦多研究化学品公司，批号：6-CWA-95-2），20β-DHP 对照品（美国TLC Pharma Chem 公司，批号：4047-033-A4），孕酮（上海源叶生物科技有限公司，批号：W08J12H136927），噻唑蓝（MTT，美国Biofroxx 公司，批号：829Z0514），胎牛血清（美国Hyclon 公司，批号：DD19099560），胶原酶Ⅰ型（美国Sigma 公司，批号：C0130-100MG），荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1032），兔Vimentin（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：1033-1-AP），RESC 培养基（武汉普诺赛生物科技有限公司，批号：WH01112107XP），Trizol Reagent 试剂盒(美国Invitro⁃gen 公司，批号：350112），PrimeScript RT reagent Kit试剂盒（美国Takara 公司，批号：AKF1919A），TB Green Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量试剂盒（Takara 公司，批号：AKE1154A），引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 实验动物SPF级雌性SD 大鼠，6～8周龄，购自新疆医科大学动物实验中心[许可证号：SCXK（新）2018-0002]，饲养温度20℃～25℃，湿度40%～70%，均自由进食饮水。

1.4 方法

1.4.1 20β-DHP 的制备将P4 在无水条件下经氢化铝锂还原，二氧化锰局部氧化得到粗产物，合成路线见图1。将粗产物经硅胶柱层析（75%正己烷/乙酸乙酯）纯化后得20-DHP。配制3 mg/mL 的20-DHP 甲醇溶液，注入半制备高效液相色谱仪，经COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ（20ID×250 mm）分离得到20β-DHP。半制备高效液相色谱条件为：流动相为甲醇-水（v：v=85：15），等度洗脱，进样体积为1 mL，流速为3.0 mL/min，检测波长为241 nm。根据检测器色谱峰，分别收集流出液。将相应流出液合并浓缩、干燥后进行结构表征和HPLC 分析。HPLC 色谱条件为：Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），等度洗脱，流动相为甲醇：乙腈：水=35：35：30，流速为0.8 mL/min，检测波长为241 nm，进样体积为10 μL。

图1 20-DHP的合成路线图

1.4.2 RESC 的原代提取与培养将大鼠处死后分离子宫内膜层组织，剪成碎块，用含双抗PBS 清洗，37 ℃下消化液（胶原酶Ⅰ）消化45 min 后用等体积胰酶消化30 min，加入FBS终止消化，轻轻吹打，消化液300 r/min 离心5 min，保留上清液，将上清液2 000 r/min 离心8 min，保留细胞沉淀。用RESC 完全培养基重悬细胞，接种于多聚赖氨酸预先包被的培养皿中，置于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中，1 h 后更换培养基，每3天换液1次，待细胞长满后备用。

1.4.3 RESC 的免疫荧光鉴定将预先处理过的玻片放置于培养皿中，接种细胞于玻片上，待细胞接近长成单层后取出玻片，用PBS 浸洗、4%的多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 室温通透20 min，PBS 浸洗后滴加正常山羊血清封闭30 min。吸掉封闭液，滴加一抗（Vimentin，稀释比为1∶100）4 ℃孵育过夜。次日加荧光标记羊抗兔IgG（稀释比为1∶100）孵育1 h。滴加荧光染料DAPI 避光孵育5 min，洗去多余DAPI 后封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

1.4.4 RESC 的生长曲线绘制取生长良好的细胞以105个/mL的密度接种于96孔板，每组细胞平行接种5个复孔，孵育24 h 后开始计时，于6、12、24、36、48、72、96 h 随机取出一块，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μL DMSO，震荡5 min 后测定554 nm 处吸光度值（A）。以时间（t）为横坐标，每组平均A 为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

1.4.5 20β-DHP 对RESC 增殖的影响取生长良好的3～5代细胞以104个/孔的密度接种于96孔板，孵育24 h 后进行药物干预。试验设阴性对照组（无细胞，给予完全培养基）、空白组（有细胞，给予完全培养基）、P4 阳性对照组（给予不同浓度的含P4 完全培养基）、20α-DHP 组（给予不同浓度的含20α-DHP 完全培养基）、20β-DHP 组（给予不同浓度的含20β-DHP 完全培养基）。根据分组给予不同处理，实验组的浓度范围均为0～40 μg/mL，每个浓度设置5 个复孔，分别于4、8、12、24 h 取出。每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，再继续培养4 h。弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡5 min，酶标仪测定554 nm 处的吸光度值，计算细胞存活率：

1.4.6 20β-DHP 对RESC 中PR、PCNA 表达的影响取生长良好的细胞以5×106个/孔接种于96 孔板，24 h 后，分为空白组、P4 阳性对照组、20α-DHP组、20β-DHP 组，各给药组浓度均为10 μg/mL，干预时间分别为12、24 h，采用Trizol法分别提取每组细胞总RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit 将总RNA 逆转录为cDNA，各组取0.2 μL cDNA 配制10 μL 荧光定量反应体系，放入PCR 仪中进行扩增，扩增程序为:95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40个循环。记录CT值，采用2-ΔΔCT法计算各组基因的相对表达量，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.5 统计学处理采用SPSS 26.0 统计学软件对数据进行统计分析，多组间数据的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 20β-DHP 的制备及结构表征合成产物20-DHP 的半制备HPLC 图见图2。由图2 可知，20α-DHP、20β-DHP 的保留时间分别为61.5、75.26 min，二者色谱峰分离度良好。收集色谱峰2对应流出液，浓缩干燥后得20β-DHP。采用红外光谱（IR）、氢核磁共振谱（Proton Nuclear Magnetic Resonance,1HNMR）、碳核磁共振谱（Carbon Nuclear Magnetic Reso⁃nance,13C-NMR）、电喷雾质谱（Electro-spray Ioniza⁃tion Mass Spectrum, ESI-MS）对其进行结构表征，数据如下：IR ν(KBr) : 3526, 2947, 2870, 1674, 1612 cm-1;1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 5.73 (d,J= 1.8 Hz,1H, C4-H), 3.74 (dt,J= 9.8, 6.1 Hz, 1H, C20-H), 2.47-0.91 (m, 27H), 1.19 (s, 4H, C19-H), 1.15 (s, 2H, C21-H),0.80 (s, 3H, C18-H);13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 199.63, 171.49, 123.75, 70.45, 58.32, 55.30, 53.77,42.33, 39.62, 38.60, 35.66, 35.43, 33.94, 32.87, 32.02,25.56, 24.42, 23.72, 20.87, 17.36, 12.40; ESI-MS m/z：317.06([M+H]+,C21H32O2理论值317.25)。在此色谱条件下，制备的20β-DHP色谱峰对称性良好，保留时间为23.2 min，纯度为96.27%。

图2 粗产物20-DHP的半制备HPLC图。

2.2 原代培养RESC 的镜下检测原代提取的RESC镜下呈类纤维细胞形态，两头尖中间稍宽，呈梭形。经传代培养后，RESC呈多角形，见图3。

图3 RESC光学显微镜下形态图（50×）

2.3 RESC 的免疫荧光染色红色荧光为基质细胞细胞质Vimentin 阳性，核为蓝色，Image J 软件统计结果显示细胞阳性率>90%，表明细胞纯度达90%以上，RESC的免疫荧光鉴定结果见图4。

图4 RESC免疫荧光图

2.4 RESC 的生长曲线绘制RESC 生长曲线呈S 型，在接种后的前12 h 时，细胞生长缓慢，细胞活力无明显上升，处于缓慢期。在12～48 h 内，细胞生长迅速，活力呈指数升高，处于对数生长期。在48 h 后，细胞生长活力未见明显变化，处于平稳期，见图5。

图5 RESC生长曲线

2.5 20β-DHP 及其同分异构体20α-DHP 对RESC 增殖的影响与空白组（0 μg/mL）相比，干预时间相同时，不同浓度的P4、20α-DHP、20β-DHP 对RESC 细胞增殖的影响不同，在0～10 μg/mL 范围内，P4、20α-DHP、20β-DHP 干预RESC 后，细胞存活率几乎都随着给药剂量的增加而升高，呈现明显的浓度依赖性；相同浓度的P4、20α-DHP、20β-DHP 干预后不同时间的RESC 存活率未呈现出规律性，没有表现出时间依赖性。与空白组（0 μg/mL）相比，20α-DHP 和20β-DHP 均表现出类似P4 的促进增殖作用，图6b、6c 中2.5～5 μg/mL20α-DHP 和20β-DHP 给药8 h 时RESC 的存活率低于100%，差异无统计学意义（P>0.05）。3 种药物干预12 h 时对RESC 增殖的促进作用最为明显，给药时间延长到24 h，细胞存活率略有下降，见图6。进一步分析干预12 h 和24 h 后的结果发现，干预12 h后，P4组在10 μg/mL时细胞存活率达到最高，而20 μg/mL 时存活率略有下降；20α-DHP和20β-DHP 组最高存活率值均在20 μg/mL 出现；干预24 h 时，P4 组最高存活率在10 μg/mL 出现；20α-DHP 干预后存活率呈持续上升趋势，在10 μg/mL 时与空白组相比增殖作用就已经具有显著性差异（P<0.05）；20β-DHP 干预后峰值在20 μg/mL 出现，见图7。因此为方便3 种药物在同一浓度水平上进行比较，后续实验选择在10 μg/mL进行基因水平的考察。

图6 不同药物浓度干预不同时间后RESC的增殖情况

图7 不同药物干预12、24 h后RESC的增殖情况

2.6 20β-DHP 及其同分异构体20α-DHP 对RESC 中PR、PCNA 表达的影响药物干预12 h 时，与空白组相比，3 种药物对PCNA 基因表达量均有明显的上调作用，对PR基因表达量有显著的下调作用，差异有统计学意义（P<0.05）。药物干预24 h 时，20α-DHP 与P4 对PR、PCNA 基因表达量的影响趋势与干预12 h 时类似，与空白组相比，20β-DHP 对PR基因表达的影响差异无统计学意义（P>0.05）。与P4组相比，20α-DHP 干预12、24 h 时对RESC 中PR、PC⁃NA 表达呈现相同的调节作用，差异无统计学意义（P>0.05），见图8。

图8 不同药物干预对RESC中PR、PCNA 基因表达量的影响

3 讨论

子宫内膜是天然孕激素黄体酮主要的靶器官，也是各种雌性激素作用的靶器官[9]，主要由基质细胞和腺上皮细胞组成[10]。基质细胞属于成纤维细胞，其在上皮细胞的发育、生长和维持功能方面发挥着重要的作用，原代子宫内膜基质细胞的分离培养可为研究子宫内膜基质细胞的生理功能及卵巢激素对子宫内膜作用奠定基础[11]。目前未见分离培养来自大鼠的原代子宫内膜基质细胞的报道，本研究通过酶消化法、差速离心法分离得大鼠子宫内膜基质细胞，并通过免疫荧光鉴定、生长曲线绘制确证其种类及成纤维细胞生长特性，结果显示分离培养的RESC 活力良好，能够满足进一步实验的需要。

黄体酮能够诱导子宫内膜基质细胞增殖[12]，其对靶细胞的（基因组、非基因组）作用通过结合孕酮受体（PR）发挥作用[13-14]，而对于其代谢产物20α-DHP及其同分异构体20β-DHP的作用鲜有报道。本研究结果表明，与黄体酮相比，20β-DHP（实验室制备，纯度为96.27%）在12 h 内具有类似的促进RESC 增殖、下调PR 表达的孕激素样作用，但孕激素样作用受时间的影响，24 h 表现与12 h 有所差别；其同分异构体20α-DHP 对RESC 增殖及PR 表达的作用与黄体酮无明显差异。PCNA 是一种仅在增殖细胞中合成与表达的多肽（36 kDa），是DNA 多聚酶δ 的一种辅助蛋白[15]，其含量能够反映细胞增殖的程度[16]。本研究结果表明，与黄体酮类似，20β-DHP 及其同分异构体20α-DHP 均能上调PCNA 的表达，与MTT 试验的结果（三种化合物均能促进RESC 的增殖）一致。本研究以黄体酮为对照，初步探讨了20β-DHP 及其同分异构体20α-DHP 对RESC 的促增殖作用，及其对PR和PCNA 表达的影响，后续有待深入探究两种同分异构体对PR 和PCNA 表达的调节机制，为开发利用20α-DHP和20β-DHP提供实验依据。