β-胡萝卜素调节NLRP3炎症小体抑制金黄色葡萄球菌性乳腺炎的实验研究

葛 鑫，陈潇菲

（山东省德州市妇女儿童医院检验科,山东德州 253015）

急性乳腺炎是乳腺的急性化脓性感染，是乳腺管内和周围结缔组织炎症，多系金黄色葡萄球菌感染所致。临床引起乳腺炎的常见细菌有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌等, 金黄色葡萄球菌是主要的病原菌[1]。近年来金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性有升高之势，目前临床上多采用抗生素治疗急性乳腺炎。β-胡萝卜素属于天胡萝卜素或类胡萝卜素家族，它在植物中大量存在，是水果和蔬菜中黄色和橘色的主要来源[2]。β-胡萝卜素可以增强血液嗜中性粒细胞对细菌的杀伤力[3]，还具有抗炎和抗氧化作用[4-5]，可以通过抑制氧化应激反应对新生小鼠坏死性小肠结肠炎发挥保护作用[6]。本研究采用小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎模型，探究β-胡萝卜素抑制金黄色葡萄球菌性乳腺炎的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物40只60日龄BALB/c雌性孕鼠购自济南朋悦实验动物繁殖有限公司[SCXK(鲁)2019-0016]。饲养于德州市妇女儿童医院动物房[SYXK(鲁)2017-0027]，饲养环境为(24±1)℃，湿度50%～60%。

1.2 仪器与试剂HS-4000 型生物组织冰冻切片机（金华市华速科技有限公司），DYCZ-22A型单垂直电泳仪（上海向帆仪器有限公司），DXI800 型全自动化学发光仪（美国贝克曼库尔特公司），ELx808 型酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。β-胡萝卜素（上海麦克林生化科技有限公司，批号204350）。金黄色葡萄球菌(ATCC29213)（天津康希諾生物股份公司，批号20180309）。小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒（武汉Cusabio Biotech 公司，批号：20190101）。Trizol 试剂（美国Invitgen 公司，批号：090823）。逆转录酶合成试剂盒购（日本Takara公司，批号：200312）。SYBR PreMix Ex TaqTM II（武汉博士德生物工程有限公司，批号20200305）。BCA 蛋白检测试剂盒（英国Abcam 公司，批号0523100）。NLRP3 单克隆抗体（北京宝日医生物技术有限公司，批号20210405），Caspase-1 单克隆抗体（北京宝日医生物技术有限公司，批号20200912），Pro-IL-1β 单克隆抗体（北京宝日医生物技术有限公司，批号20210802），GAPDH 单克隆抗体（北京宝日医生物技术有限公司，批号20100305）。

1.3 动物模型的建立与分组取40 只BALB/c 雌性孕鼠，乳腺基部注入100 μL 金黄色葡萄球菌(105CFU/mL)诱发乳腺炎，随机分为对照组(Con 组)、β-胡萝卜素组(Car 组)、金黄色葡萄球菌感染组(Sta 组)、β-胡萝卜素＋金黄色葡萄球菌感染组(Car+Sta 组)，每组10只。Con 组和Sta 组饲喂基础日粮至取样，Car 组和Car+Sta 组饲喂补β-胡萝卜素日粮。产后4 d，Sta 组和Car+Sta 组分别经乳腺基部注入100 μL 金黄色葡萄球菌(105CFU/mL)。Con 组和Car 组，分别注入同等体积生理盐水。实验低β-胡萝卜素基础饲料参照南方医科大学动物营养与饲料科学实验室AIN-93实验啮齿动物纯净饲料标准配制的。补β-胡萝卜素日粮在基础饲料上添加0.2 mg/kg β-胡萝卜素。所有小鼠均饮用蒸馏水。禁食24 h 后，所有小鼠脱臼处死，采集乳腺组织样本。

1.4 指标的测定

1.4.1 组织病理学检查实验结束后处死小鼠，完整取下乳腺组织，10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，烤片，冷却后低温冻存。经二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化。苏木精染色30～60 s，冲洗5 min，伊红染色30 s，冲洗5 min；乙醇梯度脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察。

1.4.2 Western blotting 检测将乳腺组织保存于-80°C深冻冰箱。组织裂解产物在4°C 下12 000 r/min 离心5 min，收集上清液，测定蛋白质浓度。将2.5 μL 蛋白负载到10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，转移到PVDF 膜上，随后用下列抗体探测印迹：兔抗NLRP3(1∶1 000)，兔抗Caspase-1(1∶1 000)，兔抗Pro-IL-1(1∶1 000)，兔抗GAPDH(1∶1 000)。以GAP⁃DH作为内参，与二抗在室温下孵育2 h。用ECL法发光，IMAGE J软件分析蛋白条带的灰度值。

1.4.3 RT-PCR 检测用Trizol 法提取乳腺组织中的总RNA,通过反转录获取cDNA，采用荧光定量试剂盒（美国Thermo Fisher 公司）进行检测，按试剂盒说明书进行操作。用2-△△Ct法计算乳腺组织中IL-1β相对表达量。IL-1β引物序列为：正义链5'-GGAAGCTGCTG⁃GAAACCATC-3'，反义链5'-CCGCACACTCCTTC⁃TATTTGAA-3'。β-actin 引物序列为：正义链5'-TC⁃GTGTCCTGTATGCCTCT-3'，反义链5'-TTTGATGT⁃CACCGACGATTT-3'。

1.4.4 ELISA 检测称取乳腺组织样本50 mg，用RIPA裂解缓冲液研磨，直至匀浆，匀浆在4°C 下以12 000 r/min 离心15 min，收集上清液。按ELISA 试剂盒说明书操作检测IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平。

1.5 统计学处理采用SPSS19.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析和Dunnett检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况及乳腺组织学比较与Con组相比，Car 组小鼠饮食、饮水正常，活动量无明显减少。Sta 组小鼠进食量、饮水量均显著减少、精神萎靡、弓背蜷缩。Car+Sta 组小鼠精神较Con 组明显较差，但活动意愿明显强于Sta 组。肉眼观，Con 组与Car 组小鼠乳腺组织呈淡粉色，有光泽（图1-A，1-B）。Sta 组小鼠乳腺呈潮红色，血管数量显著增多，局部可见出血点和出血斑（图1-C），Car+Sta 组乳腺组织较Con 组体积轻微增大、可见血管数量稍增多（图1-D）。

图1 各组小鼠乳腺大体组织学病理检测图

2.2 各组小鼠乳腺组织病理学的变化Con组和Car组乳腺组织无明显病理改变。Con 组腺泡轮廓不清，腺泡连接不紧密，与Con 组（图2-A）相比，Car 腺泡轮廓更清晰，腺泡连接更紧密(图2-B)。与Con 组和Car组相比，Sta 组腺泡上皮细胞层变薄、脱落(图2-C)，同时腺泡内可见上皮细胞碎片与中性粒细胞(图2-C)。Car+Sta 组腺泡内仍可见上皮细胞碎片与中性粒细胞混杂(图2-D)，但腺泡结构较Sta组完整，见图2。

图2 各组小鼠乳腺组织学病理检测图

2.3 各组小鼠乳腺组织中炎性因子水平比较与Con组和Car 组比较，Sta 组IL-6、TNF-α 和IL-1β 表达水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Sta组比较，Car+Sta 组IL-6、TNF-α 和IL-1β 表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 各组小鼠乳腺组织中炎性因子表达水平比较（ng/mL，±s）

表1 各组小鼠乳腺组织中炎性因子表达水平比较（ng/mL，±s）

注：与Con组比较，aP<0.05；与Car组比较，bP<0.05；与Sta组比较，cP<0.05。

指标IL-6 TNF-α IL-1β Con组6.22±0.68 8.45±0.77 14.85±1.25 Car组6.45±0.71 8.64±0.82 15.12±1.36 Sta组14.45±0.96ab 15.87±1.05ab 30.25±3.20ab Car+Sta组8.98±0.94c 10.25±1.02c 20.14±2.84c F P<0.001<0.001<0.001 86.254 94.586 187.639

2.4 NLRP3 炎症小体表达的变化与Con 组和Car 组比较，Sta 组NLRP3、Asc、Caspase-1 和Caspase-1 p20表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Sta组比较，Car+Sta 组NLRP3、Asc、Caspase-1 和Cas⁃pase-1 p20 表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），表2。

表2 各组NLRP3，Asc，Caspase-1和Caspase-1 p20蛋白表达水平比较（±s）

表2 各组NLRP3，Asc，Caspase-1和Caspase-1 p20蛋白表达水平比较（±s）

注：与Con组比较，aP<0.05；与Car组比较，bP<0.05；与Sta组比较，cP<0.05。

指标NLRP3 Asc Caspase-1 Caspase-1 p20 Con组0.48±0.09 0.54±0.10 0.53±0.08 0.46±0.07 Car组0.50±0.09 0.55±0.11 0.49±0.12 0.49±0.09 Sta组0.74±0.10ab 0.89±0.12ab 0.88±0.11ab 0.69±0.10ab Car+Sta组0.58±0.08c 0.70±0.18c 0.60±0.12c 0.54±0.09c F P<0.001<0.001<0.001<0.001 23.969 32.630 21.000 20.391

2.5 各组pro-IL-1β 蛋白及mRNA 表达水平比较与Con 组和Car 组比较，Sta 组pro-IL-1β 蛋白和mRNA 表达水平较高，差异有统计学意义（P<0.05）。与Sta 组比较，Car+Sta 组pro-IL-1β 蛋白和mRNA 表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 各组pro-IL-1β蛋白及mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组pro-IL-1β蛋白及mRNA表达水平比较（±s）

注：与Con组比较，aP<0.05；与Car组比较，bP<0.05；与Sta组比较，cP<0.05。

指标Con组Car组Sta组Car+Sta组F P pro-IL-1β蛋白0.25±0.02 0.24±0.05 0.46±0.09ab 0.31±0.08c 18.006<0.001 pro-IL-1β mRNA 4.12±0.08 4.07±0.07 15.09±2.78ab 6.08±1.11c 49.023<0.001

3 讨论

急性乳腺炎如果处理不及时，病程往往拖延很长，严重者可并发全身化脓性感染，给患者造成极大痛苦，同时也会影响婴儿的正常哺乳[7]。急性乳腺炎未形成脓肿之前，应用抗生素可取得较好效果。但是近年来金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性有升高之势[1]。因此，需要寻找新的治疗药物。本研究发现，β-胡萝卜素可通过调节NLRP3 炎症小体起到抗炎作用，可能用于治疗急性乳腺炎。

β-胡萝卜素是一种重要的抗氧化剂，对改善免疫炎症性损伤也有一定作用[2]。有研究显示，β-胡萝卜素可以增强血液嗜中性粒细胞对细菌的杀伤力[3]。有研究表明，Toll 样受体（TLR）家族成员能识别保守的微生物结构，如细菌脂多糖（LPS）和病毒双链RNA，并且能够激活一些信号通路，引起抗微生物感染的免疫应答，β-胡萝卜素可能通过调节TLR2 信号通路来调节金黄色葡萄球菌乳腺炎的炎症反应[8]。研究发现给奶牛饲料中添加β-胡萝卜素，可以减少奶牛急性乳腺炎的发生[9]。

本研究建立了金黄色葡萄球菌乳腺炎小鼠模型，检测补充β-胡萝卜素对NLRP3 炎症小体的调节作用。研究结果显示，适当补充β-胡萝卜素可以改善产后乳腺的整体代谢。Sta 组和Sta+Car 组均可见明显的上皮细胞脱屑、腺泡内上皮细胞与中性粒细胞混合等病理改变，但Sta+Car 组病变较Sta 组轻，提示金黄色葡萄球菌感染可引起严重的乳腺病变，补充β-胡萝卜素有助于减轻这些病变。

NLRP3 炎症小体是由NLRP3，Asc 和caspase-1组成的蛋白[10]。NLRP3 作为一个传感器可以被细胞内的金黄色葡萄球菌结合，ASC 是调节NLRP3和cas⁃pase-1 之间相互作用的关键因子，而caspase-1 作为一个效应器将细胞因子裂解成熟的生物活性形式。有研究表明，NLPR3 炎症小体在小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎的发生发展中起着重要作用[11]。本研究发现，Con 组与Car 组NLRP3、ASC、Cappase-1 和Cas⁃pase-1 p20 的表达无明显差异，提示两组均无炎症反应。金黄色葡萄球菌显著增加NLRP3、ASC、Cas⁃pase-1 和Caspase-1 p20 的表达，提示NLRP3 炎症小体参与了对金黄色葡萄球菌的免疫应答。与Sta组相比，饲料补β-胡萝卜素可抑制这4 种蛋白的表达。研究结果表明，日粮β-胡萝卜素对NLRP3 炎症小体具有调节作用。炎性细胞因子在调节炎症过程中起着重要作用，适量的细胞因子水平有利于免疫效应细胞抵抗感染，但细胞因子的过度反应也会对细胞和组织造成损伤[12-13]。IL-1β 与NLRP3 炎症小体表达水平相关，在急性乳腺炎的发病过程中起到重要作用[14-15]。本研究中，与Sta组相比，Car+Sta组中乳腺中pro-IL-1β蛋白和mRNA 较低，说明β-胡萝卜素能够降低pro-IL-1β表达水平。

综上所述，本研究发现金黄色葡萄球菌乳腺感染激活了NLRP3 炎症小体，并导致proIL-1β 的表达，β-胡萝卜素可通过调节NLRP3炎症小体起到抗炎作用。本研究也存在一些局限性，例如未分析NLRP3下游炎症相关信号通路的变化；未直接分析β-胡萝卜素对金黄色葡萄球菌的抑制作用，未来需要深入研究。