栝楼的组织培养

熊国宇， 来喜月， 陆海悦， 何克勤

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)为葫芦科栝楼属, 多年生攀缘型草本植物, 别名瓜蒌、吊瓜、药瓜，主产于安徽、山东、河南、河北、陕西等地，其全身均可药用或食用[1-2]。其果实(全瓜蒌)有清热涤痰的功效；种子(瓜蒌仁)可直接作为休闲食品或药用；块根(天花粉)是常用的中药[3-4]，具有清热生津、清肺润燥的功效；皮(瓜蒌皮)可利气宽胸、清热化痰的功效[5-6]。

栝楼通常采用种子播种和块根营养繁殖两种方式。种子繁殖会造成雌雄比例严重失调，幼苗时期雌雄株没有明显的差异，很难区别，造成大量雄株浪费，影响产量[7-8]；同时种子繁殖易造成种苗不齐、种质混杂及品种退化等现象[9-10]。而采用块根营养繁殖需许多的地下块茎，由于块根也是药材，导致繁殖系数较低；同时根块繁殖易传播病虫害及造成病毒的积累，尤其是根结线虫病和根腐病，导致果实产量与品质严重退化[11-13]。植物组织培养在保持原有品种的优良性状的基础上，繁殖周期短、系数大，还不受外界环境条件的影响，加速良种的繁殖[14-15]。本试验以“皖蒌9号”茎尖为外植体，研究不同外源激素种类及浓度对其组织培养的影响，以期获得高效离体再生体系，为栝楼的种苗繁殖及工厂化育苗提供技术服务。

1 材料与方法

1.1 供试材料

栝楼品种为‘皖篓9号’，由安徽蚌埠清菲农业科技有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 基本培养基配制及培养条件 本试验采用基本培养基为MS、蔗糖30 g/L、琼脂5 g/L，pH值调为6.0左右后分装在组培瓶中，121 ℃高压灭菌20 min,冷却备用。接种后培养温度为25 ℃左右，光照3 000 lx、12 h/d。

1.2.2 无菌苗的获取 田间选取生长健壮的栝楼2 cm左右茎尖，先用自来水冲洗表面灰尘，再用洗衣粉溶液清洗，最后放超净工作中用75%酒精和0.1%升汞消毒，具体处理时间见表1，用酒精和升汞消毒后分别用无菌水清洗4～5遍。将消毒好的茎尖放在解剖镜下进行生长点剥离，切取1 mm左右生长点接入基本培养基中培养，每瓶接种1个，每处理接种30瓶，3次重复。培养20 d后统计污染率、死亡率和成苗率。

1.2.3 茎尖再生的正交试验 在不同消毒剂处理试验的基础上，选取茎尖，洗涤，用75%酒精消毒40 s+0.1%升汞消毒6 min。将消毒好的茎尖放在解剖镜下剥离1 mm左右生长点接入不同激素培养基中培养，具体激素浓度见表2，每瓶接种生长点2个，每处理接种15瓶，3次重复。培养30 d后统计再生芽数。

1.2.4 茎段增殖 剪取茎尖再生无菌苗1 cm左右茎段接入不同处理的增殖培养基中，具体处理见表3～4，每处理接9瓶，3瓶1个重复，3次重复，每瓶接茎段4个。培养30 d后统计再生芽数、株高和再生苗生长情况。

1.2.5 茎段生根 剪取茎尖再生无菌苗1 cm左右茎段接入不同处理的生根培养基中，具体处理见表5，每处理接9瓶，3瓶1个重复，3次重复，每瓶接茎段4个。培养25 d后统计生根率、根数、根长和再生苗生长情况。

1.2.6 试验数据处理 增殖倍数=再生苗总数/接种茎段总数×100%；生根率=再生苗生根总数/接种茎段总数×100%。试验数据采用Excel、DPS软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂处理对茎尖再生的影响

由表1可知，不同消毒时间处理对茎尖离体再生有极显著的影响。当75%酒精处理时间一定时，随着0.1%升汞处理时间的延长，茎尖污染率逐渐降低，死亡率逐渐升高；当0.1%升汞处理时间一定时，随着75%酒精处理时间的延长，茎尖污染率、死亡率无规律性变化。处理T5的成苗率最高，为83.8%，与其他处理均达到了极显著差异，其污染率、死亡率相对较低，分别为11.1%、5.1%。处理T1污染率最高，死亡率最低，分别为36.5%、2.4%；处理T9污染率最低，死亡率最高，分别为3.4%、38.4%；综合考虑可得，T5(75%酒精40 s+0.1%升汞6 min)为最适茎尖外植体消毒组合。

表1 不同消毒时间对茎尖离体培养影响

2.2 正交试验对茎尖再生芽数的影响

由表2可知，极差R值最大为28.33，最小为8.67；6-BA浓度的变化对再生芽数影响最大，为主要影响因子；KT浓度的变化对再生芽数影响最小；4个影响因素主次顺序为6-BA>IBA>NAA>KT。因素6-BA的3个水平的k值分别为103、74.67、80.33，即第一水平0.2 mg/L为最好水平；因素IBA的3个水平的k值分别为79.67、81.33、97.00，即第三水平0.2 mg/L为最好水平；因素NAA的3个水平的k值分别为77.00、94.00、87.00，即第二水平0.03 mg/L为最好水平；因素KT的3个水平的k值分别为80.33、88.67、89.00，即第三水平1.5 mg/L为最好水平。

表2 再生芽数的极差分析

2.3 不同激素组合对栝楼茎段增殖的影响

2.3.1 不同浓度6-BA和NAA组合对增殖的影响 由表3和图1可得，不同浓度6-BA、NAA组合对再生苗增殖均有影响，增殖倍数和株高相比对照均达到了显著性差异。当6-BA浓度相同时，随着NAA浓度的增加增殖倍数先增大后减小，株高无规律变化，高浓度的NAA对增殖有一定抑制作用；当NAA浓度相同时，随着6-BA浓度的增加增殖倍数先减小后增加，所试范围内高浓度的6-BA对增殖有促进作用。处理N8再生苗的增殖倍数、株高分别为5.42、2.12 cm，茎节正常伸长、叶色淡绿；增殖倍数与各处理达到了显著性差异且最大，株高与处理N1、N2、N3、N4、N6、N9差异不显著。因此，最适栝楼茎段增殖激素组合为0.4 mg/L 6-BA和0.06 mg/L NAA。

表3 不同浓度6-BA、 NAA组合对增殖的影响

图1 栝楼增殖的不同处理

2.3.2 不同浓度6-BA和IBA组合对增殖的影响 由表4和图1可知，不同浓度6-BA 、IBA组合对再生苗增殖均有不同程度的影响，增殖倍数和株高相比对照均达到了显著性差异，各处理之间增殖倍数和株高差异比较小。处理I4(6-BA 0.2 mg/L、IBA 0.02 mg/L)的增殖倍数、株高分别为3.25、2.29 cm，增殖倍数与处理I1、I2、I3、I6、I7、I9均达到了显著差异，株高与各处理间差异不显著。

相比6-BA 、NAA组合对增殖的影响，6-BA 、IBA组合的增殖系数普遍不高，但再生苗生长状态普遍茁壮点。因此，筛选出较好促进栝楼茎段增殖激素配方为0.4 mg/L 6-BA 和0.06 mg/L NAA组合。

表4 不同浓度6-BA、 IBA组合对增殖的影响

2.4 不同浓度生长素对生根的影响

由表5和图2可知，添加不同浓度的NAA、IBA均能不同程度促进栝楼生根，生根率均未达到100%，浓度过低或过高均抑制再生根的生长。NAA处理的整体生根率要高于IBA，其中A3(NAA为0.15 mg/L)的生根率最高，为95.1%，但再生苗生长质量较弱，A2、A3处理根有部分增粗成畸形，不易移栽成活。IBA不同浓度处理的再生根生长较正常，侧根较多，苗较大，其中B4(IBA为1.0 mg/L)处理的生根率相对较高，为92.2%，根数为5.3个，根长为7.6 cm，叶淡绿，苗较壮，为栝楼较适生根浓度。

表5 不同浓度的NAA、IBA组合对生根的影响

图2 栝楼生根的不同处理

3 结论与讨论

本试验研究得出：75%酒精和0.1%升汞不同时间组合消毒处理对再生苗成苗率、污染率和死亡率均有明显的影响，其中最适茎尖外植体消毒组合为75%酒精40 s+0.1%升汞6 min；不同植物生长素对茎段增殖、生根均有不同影响，6-BA、NAA组合整体优于6-BA、IBA组合，且最适增殖浓度为(0.4 mg/L 6-BA)+(0.06 mg/L NAA)，增殖倍数较高，为5.42，茎节正常伸长、叶色淡绿；最适生根激素浓度为1.0 mg/L IBA，生根率较高，为92.2%，根数较多，为5.3个，叶淡绿，苗较壮。

组织培养中，外植体的初代培养消毒是一个难题，常用的消毒剂有次氯酸、酒精和升汞。黄崇成等[16]研究石豆兰无菌材料的建立及离体培养初探得出升汞消毒外植体最适时间为10 min，这与本试验外植体消毒时间不同，可能是不同材料、不同部位的耐受能力不同。本试验材料是春天时选取生长在田间的健壮栝楼植株的茎尖，通过优化适宜消毒时间和剥取生长点的大小从而提高外植体培养效率。

植物生长调节剂有生长素和分裂素两种，是组织培养中不可或缺的组成成分, 添加不同类型的生长调节剂能促进植株不同类型的生长、分化，植物离体培养过程中，激素种类和浓度的确定因植物和培养部位而异。因此，每个植物的组培繁殖体系建立均需要进行激素种类和浓度的试验筛选。蔡宣梅等[17]研究福建省道地瓜蒌组织培养体系的建立得出：最适顶芽诱导激素组合为(0.4 mg/L 6-BA)+(0.04 mg/L NAA)；最适宜的增殖激素组合为(0.6 mg/L 6-BA)+(0.05 mg/L NAA)；最适宜的生根激素组合(0.2 mg/L 6-BA)+(0.05 mg/L NAA)+(0.05 mg/L IBA)+(0.5 g/L活性炭)；郑向丽等[18]研究激素水平对福建道地瓜蒌组培快繁的影响得出：最适宜的增殖激素为1.0 mg/L 6-BA，最适宜的生根激素为0.4 mg/L NAA。周玉丽等[19]研究根用芥菜子叶和下胚轴离体再生体系的建立得出：适宜不定芽增殖激素组合为(1.0 mg/L 6-BA)+(0.2 mg/L IAA)，最适生根激素为0.2 mg/L IBA。崔广荣等[20]以茎段为外植体研究甜叶菊的组织培养得出最适增殖激素组合为(1.0 mg/L 6-BA)+(0.1～0.2 mg/L NAA)，最适生根激素为0.0～0.5 mg/L NAA或IBA。本试验结果与前人研究所用激素名称一致，具体浓度不一致，可能是因为不同植物及同一植物的不同品种对激素的耐受能力及敏感性不同造成的。

植物局部受到创伤刺激后，在适宜的条件下伤口处易形成愈伤组织。本试验中发现茎段增殖中茎基部形成较大的愈伤组织，对再生芽的生长和增殖产生一定抑制作用，愈伤在茎段基部切口形成并逐渐增大可能是因为培养基中添加的细胞分裂素浓度偏高或分裂素、生长素比例失衡。本试验下一步将开展向培养基中添加相关物质抑制愈伤生长试验和分裂素、生长素浓度进一步筛选试验，筛选出抑制愈伤形成、生长配方，为种苗的繁殖及工厂化育苗提供理论依据和技术支持。