银杏幼胚离体诱导培养技术研究

丁铁玉

【摘   要】 该试验以银杏幼胚作为外植体，以0.1%HgCl2溶液作为消毒剂，设置消毒时间为6min、8min、10min三个配比，采用4种不同配比的诱导培养基配方对银杏幼胚进行诱导培养研究。通过比较不同消毒时间下银杏幼胚的成活率、萌发率、污染率，及不同诱导培养基上银杏幼胚萌发成苗的生长状态，最后结果得出：幼胚使用0.1%HgCl2消毒8min最佳;MS+1.0 mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA配方最有利于银杏幼胚诱导。

【关键词】 银杏;幼胚;升汞;消毒时间;诱导培养

Study on in vitro induction culture of young embryos of ginkgo biloba l

Ding Tieyu

（Garden management office of  Tongyu county， Jilin province   137200）

[Abstract] In this experiment， young embryos of ginkgo biloba were used as explants， 0.1% HgCl2 solution was used as disinfectant， and three proportions of disinfection time were set as 6min， 8min and 10min. Four different proportions of induction medium formula were used for induction culture of young embryos of ginkgo biloba. By comparing the survival rate， germination rate and pollution rate of young embryos of ginkgo biloba under different disinfection time， as well as the growth status of young embryos germinating into seedlings on different induction medium， the final result was： young embryos were sterilized with 0.1% HgCl2 for 8min， which was the best. MS+ 1.0mg· l-1 6-ba +1.0mg· l-1 NAA formula is most favorable for induction of young embryos of ginkgo biloba.

[Keywords] ginkgo biloba; young embryo; mercuric chloride; disinfection time; induction training

銀杏，为银杏科银杏属植物，拉丁学名为Ginkgo biloba.L，是我国非常著名的一种乡土树种，为中生代的一种孑遗植物，被称为人类的活化石。该植物树形端庄，姿态优美，尤其叶子独特秀雅，到秋季之后一片金黄，非常美观，观赏价值极高，在园林中应用非常广泛，可以作为行道树、独赏树、林丛树等多用绿化应用。银杏常用的繁殖方法为播种繁殖，但由于其种子成熟特殊，为生理后熟，导致播种期延后，另外由于种皮较厚不容易发芽，播种繁殖需要提前进行长时间的层积催芽，这些均影响到了银杏的繁殖速度。因此本实验尝试以其幼胚为原材料，研究其离体诱导培养技术，由于整个离体培养过程复杂，该试验主要针对诱导阶段进行具体研究，以为整个银杏的离体培养奠定基础。

1  材料与方法

1.1  试验材料

本次试验开始于2018年4月～2019年4月，银杏种子购买于江苏省沭阳县新河镇好心情园艺基地。试验药品有：MS大量元素、微量元素、铁盐、有机成分所需各种药品，琼脂，NAA、6-BA等生长激素，次氯酸钠、升汞、75%酒精等消毒剂，98%浓硫酸、无菌水等;试验仪器有：高压蒸汽灭菌锅、冰箱、超净工作台、电子天平、电磁炉、不钢锅、培养箱等。

1.2  试验方法

1.2.1外植体接种方法  银杏种子用清水冲洗30min，然后将种子放入烧杯中，加入98%浓硫酸，进行浸泡，时间为2h，期间每隔10min，用玻璃棒进行搅动一次，直至银杏种子外皮基本被腐蚀。倒掉浓硫酸，用清水进行冲洗，时间为30min。在超净台内，在盛有种子的烧杯中加入75%酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗5次。用配备好的升汞消毒溶液（0.1%HgCl2）对其进行消毒，消毒时间分三个梯度，分别设为6min、8min和10min，然后用无菌水对其冲洗8次。

接种时将种子放在经过灭菌处理的铁质托盘中，用解剖刀和镊子剥去银杏种子果皮，再沿着子叶中缝将其剥开，用摄子取出完整的幼胚，小心地去除附着在幼胚表面上的白膜，不要破坏幼胚，然后将其放置在经灭菌处理过的滤纸上。将处理好的幼胚接种到不同配比的培养基中，每瓶接种1粒，1个处理设为5瓶，重复3次。最后，封好封口膜，贴好标签，将其放置于环境适宜的培养箱中培养，每隔7d观察生长状况，并做好记录。

1.2.2 诱导培养基的配比  诱导培养基设为4个配比，分别为：Y1：MS+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1NAA;Y2：MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA;Y3：MS+1.5mg·L-16-BA+1.5mg·L-1NAA;Y4：MS+2.0mg·L-16-BA+2.0mg·L-1NAA。

1.2.3 培养条件  将接种后的培养瓶放入培养箱中进行培养，培养箱湿度设置在80%。在诱导培养阶段，培养箱温度设置为（25±1）℃，光照强度设置为2000 Lx，每日光照时间设置为14 h。

2  结果与分析

2.1  0.1%HgCl2三个消毒时间对银杏幼胚的影响

幼胚接种25d后，统计各瓶中幼胚污染率、萌发率和成活率，具体结果如表1。由表1可以看出，随着消毒时间的增加，污染率逐渐降低，但萌发率和成活率也不断降低。当消毒时间为6min时，成活率较高，为81.67%，但污染率也最高，为8.33%。当消毒时间为8min时，成活率最高，为88.33%，污染率也较低，为3.33%。当消毒时间为10min时，污染率最低，为0%，但成活率陡降，为68.33%。由此可见，幼胚的最佳消毒时间为8min。

2.2  幼胚在不同诱导培养基上的生长情况

将处理好的幼胚接种至4种不同配方的诱导培养基中，各瓶中幼胚开始生长，在接种的第25 d后，统计各瓶中幼胚的生长情况，具体结果见表2。由表2看出，随着植物激素6-BA和NAA含量的增加，幼胚的生根数和整体生长形态呈倒U型分布，这说明植物激素6-BA和NAA含量的增加并非一直有利于银杏幼胚的生长。另外，幼胚茎由纤细到粗壮的变化，也说明了增加植物激素6-BA和NAA的比例会促进幼胚茎的生长。但在此过程中，茎的长度与生长形态却也随之变矮和弯曲，导致畸形苗的产生。相比较之下，配方Y2（MS+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA）更適合作为幼胚诱导培养基的配方。

3  结论与讨论

通过观察银杏幼胚在三种不同消毒时间梯度处理过的生长形态，从中综合对比出，将外植体消毒的最佳时间为8min;比较4种不同配比的诱导培养基对幼胚的诱导生根状况，得出配方MS+1.0mg·L-1 6-BA+1.0mg·L-1 NAA最有利于银杏幼胚的初代诱导。此次试验对银杏幼胚进行诱导培养，虽然在个别幼胚根部发现有少量的愈伤组织，但大部分多是生长成为幼苗，和预想的试验结果存在一定偏差。因此，在对银杏进行离体繁殖时，还需对外植体的选择、接种方法以及培养条件等做进一步的研究。希望本次试验的结论可以为银杏离体快繁技术提供一些依据，为今后深入研究银杏组培试验提供有效的试验数据，并且最终达成加速银杏产业规模化育苗的目标。

参考文献：

[1] 杨增海.园艺植物组织培养[M].北京：农业出版社，              1997：86.

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