川栝楼瓤中次生代谢物组成及相对含量分析研究△

刘青，李珮，曾其国，马艺沔，何春年，丁自勉*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193；3.成都师范学院，四川 成都 611130

栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim是葫芦科Cucurbitaceae栝楼属，为多年生药食两用、雌雄异株草质藤本植物[1]，而川栝楼(川瓜蒌1号)为栝楼T.kirilowiiMaxim的一个品种，主要种植于四川省[2]。中医称栝楼为瓜蒌，其果实、果皮和种子均被《中华人民共和国药典》收载，分别以瓜蒌、瓜蒌皮、瓜蒌仁(及炒瓜蒌仁)为药用，功效各异[3]。综合历代本草记载，瓜蒌具有清肺润燥、涤痰宽胸、利气开郁、涤痰散结、甘润解渴、润燥滑肠、清热消肿散结等功效(见表1)[4-6]。中医用于胸痹证、消渴、肠燥便秘、乳痈等[7-9]。现代中西医结合用于治疗冠心病、糖尿病等[10-15]。四川是栝楼的重要产区[16]，主要种植品种为“川瓜蒌1号”，也称为“川栝楼”。川栝楼作为农民药用植物脱贫致富的新资源，产量巨大，在生产过程栝楼瓤通常作为废弃物被抛弃，造成资源浪费和环境污染。对栝楼瓤的药理作用及其成分的研究报道尚少，为了综合利用川栝楼药用资源，本研究通过对川栝楼不同部位的成分进行检测，并将栝楼瓤与药用部位的栝楼皮和栝楼仁进行比较分析，以揭示川栝楼瓤的差异化学成分及相对含量，为栝楼瓤的开发利用提供科学数据和参考依据。

1 材料

1.1 样品环境概况

苍溪县地处四川盆地北缘、大巴山南麓之低、中山丘陵地带，介于东经105°43′～106°28′与北纬31°37′～32°10′，幅员2 346.46 km2。受米仓山、大巴山构造控制，地势由东北向西南倾斜，山脉呈北、北东弧形走向，最高九龙山主峰海拔1 377.5 m，回水、石门、歧坪一线以南为低山深丘区，山丘多呈桌状及台阶状，沿江可见冲积层阶地，境内江河纵横，切割剧烈，地形复杂，岭陡谷深，平坝、台地、丘陵、低山、低中山及山塬地貌皆有[17]。低山丘陵最适宜川栝楼的生长，本研究样品采集为苍溪县陵江镇玉女村川栝楼生产基地的鲜果，储藏并保鲜送中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所检测分析。

1.2 样品处理

将部分栝楼鲜果切开，分成皮、瓤、仁及全果4个部分作为样品实验(见图1)，先将4类样品用鼓风干燥箱在50 ℃下干燥36 h左右，栝楼仁、栝楼皮基本烘干，从干燥箱中取出，放冷，粉碎；栝楼瓤和全果含水量较多，将其转移至真空干燥箱，在50 ℃下继续干燥50 h，全果样品取出后粉粹；栝楼瓤干燥后具有一定的黏度，转移至冰箱中，在-20 ℃条件下放置2 h左右，用研钵将其捣碎，捣碎后的样品栝楼、栝楼皮、栝楼瓤和栝楼仁分别用F、P、N和S进行分类编号。

1.3 仪器

Dionex UltiMate 3000(Thermo Fisher科技有限公司)；Acquity UPLC SynaptG2 HDMS系统(美国Waters公司)；AL204型梅特勒-托利多万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；超纯水仪(Millipore公司)；数控超声波清洗器(KQ5200DE型，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)。

1.4 试剂

甲醇、二氯甲烷(分析纯，北京化工厂)；超纯水(Millipore，法国)；甲醇(色谱纯，Honeywell)；3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇对照品(成都普瑞法科技开发有限公司，纯度：98%，批号：PRF8112821)。

表1 瓜蒌不同部位的药理作用

图1 川栝楼样品处理

2 方法

2.1 高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)含量测定

按照2015版《中华人民共和国药典》(一部)栝楼含测项下进行检测[3]。

2.1.1色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇∶水=93∶7；流速：0.5 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；检测波长：230 nm。

2.1.2对照品溶液配制 取 3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇对照品约1 mg，精密称定，加入二氯甲烷配制对照品溶液，质量浓度为0.13 mg·mL-1。

2.1.3供试品溶液的制备 精密称取栝楼各部位干燥粉末约1.0 g，置量瓶中，加入二氯甲烷至刻度线下约1 cm处，超声提取30 min，取出，放冷，二氯甲烷定容至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS代谢物测定

2.2.1色谱条件 Waters HSS T3 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)。流动相(A)为1%甲酸水，流动相(B)为乙腈，梯度洗脱程序(0～8 min，2%～25%B；8～10 min，25%～30%B；10～14 min，30%～100%B；14～15 min，100%～100%B；15～16 min，100%～2%B；16～19 min，2%～2%B)。柱温为30 ℃，流速为0.3 mL·min-1。进样体积2 μL。检测波长：210～400 nm。

2.2.2质谱条件 采用电喷雾负离子检测电离模式，雾化气为高纯度N2，碰撞气为高纯度He，质量扫描范围：m/z100～1200。负离子模式锥孔电压：40 V，毛细管电压：2.4 kV，离子源温度：100 ℃，脱溶剂气温度：350 ℃，脱溶剂气流速：900 L·h-1，锥孔气体流量：50 L·h-1，碰撞能量(CE)：20～40 V，LockMass：亮氨酸脑啡肽，m/z为554.261 5。

2.2.3提取方法 1)精密称取栝楼各部位干燥粉末约1.0 g，置量瓶中，加入甲醇25 mL，超声提取30 min，取出，放冷，甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm滤膜过滤，取续滤液，备用；2)取一定量上述提取液混合均匀，得到质控(QC)溶液。

2.2.4数据处理 将超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)得到的样品数据导入Waters Masslynx 4.1软件中，在MakerLynx application manager Version 4.1编辑，进行峰识别、峰对齐、基线校正和归一化等预处理，输出三维数据矩阵(由保留时间、精确分子量和峰面积组成)，最后将得到的矩阵导入Simca-P软件(13.0版本)进行主成分分析和偏最小二乘法判别分析等，对栝楼植物的不同部位进行模式识别，寻找组间差异较大的植物代谢物。

3 结果

3.1 栝楼果不同部位3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量分析

含量测定结果见表2，研究结果表明：栝楼及不同部位(栝楼皮、瓤、仁)中均含有3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇[18-19]，含量存在一定的差异，其中栝楼全果的平均质量分数为0.30%，瓤中平均质量分数最高为0.39%，皮和仁的平均质量分数为接近为0.29%和0.28%，显然栝楼瓤的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇含量最高，即栝楼瓤>栝楼>栝楼皮>栝楼仁。检测结果显示不同部位中3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇含量与栝楼成熟度有一定的关系，未完全成熟栝楼瓤中的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇质量分数最高为0.42%，高于全果的含量，栝楼仁中的质量分数最低为0.25%；栝楼完全成熟时，栝楼仁中的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的质量分数最高为0.36%，栝楼皮中的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的质量分数最低为0.26%，即栝楼仁>栝楼瓤>栝楼>栝楼皮。

表2 栝楼果不同部位3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇的含量

注：F为栝楼全果；P为栝楼皮；N为栝楼瓤；S为栝楼仁；1～4分别为代表4个不同栝楼果；其中：1～3号未完全成熟；4号完全成熟。*括号内值表示1～3号统计平均值。

3.2 栝楼果不同部位的差异代谢产物分析

3.2.1实验的质控评估 首先使用无监督的主成分分析(PCA)对QC样本及其他实验样本进行分析。QC样本成分相同，在PCA得分图中应当聚集在一起。图2的PCA得分图显示，QC样本紧密聚集，表明实验方法稳定，系统重复性较好，因此对本实验所采集的数据进行了下一步分析。

注：1.QC样本；2.其他样本。图2 QC样本与其他样本PCA得分图

3.2.2栝楼样品不同部位代谢组学分析 不同部位的栝楼样品通过UPLC-Q-TOF-MS分析所得基峰强度(BPI)色谱图见图3，图中显示栝楼的不同部位样品的色谱图有较明显差异，但仔细对比发现，大多数色谱峰相同，只是相对含量有差异；栝楼瓤中的次生代谢产物含量丰富，与栝楼皮和栝楼仁的次生代谢物相比而言，栝楼瓤中大多数均含有次生代谢物，只是相对含量高低不同，特别是在高极性部分(保留时间4.5 min以前)，色谱峰较多(但色谱峰形不好，可能为多种成分叠加造成)。

为了研究栝楼不同部位之间主成分的差异，本实验利用统计学软件Simca-P(13.0版本)对数据做进一步处理。将干燥处理的栝楼样品按照不同部位分为3组，分别为栝楼瓤、栝楼皮和栝楼仁(n=3)，继续分析栝楼瓤中的次生代谢产物，并分别进行两两比较，以寻找不同部位间的差异性次生代谢产物。

统计分析发现栝楼瓤含有鸟嘌呤(C5H5N5O)和鸟苷(C10H13N5O5)，而栝楼皮中则未检出；anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)在栝楼瓤的含量小于栝楼皮；三萜皂苷(C38H56O13)的含量栝楼瓤大于栝楼皮(见表3)。

统计分析(见表4)发现在栝楼瓤含有三萜皂苷(C38H56O13)，而栝楼仁中则未检出；在栝楼仁含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12)，而栝楼瓤中则未检出；鸟苷(C10H13N5O5)栝楼瓤的含量大于栝楼仁。

统计分析(见表5)发现在栝楼仁中含有1，4-O-diferuloylsecoisolariciresinol(C40H42O12) hanultarin(C30H34O9)和anillic acid/ isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acid(C8H8O4)，而栝楼皮中则未检出；在栝楼皮中含有vanillic acid、isovanillic acid、4-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid(C8H8O5)，而栝楼仁中则未检出。

注：从上至下依次为仁、皮、瓤。图3 栝楼不同部位样品UPLC-QTOF-MS分析BPI色谱图

表3 栝楼瓤和栝楼皮的差异代谢物含量

序号tR[M-H]-VIP值化合物鉴定化学式皮/瓤12.210 2130.086 75.40∗∗22.477 4150.043 11.75Guanine鸟嘌呤C5H5N5O+33.150 2164.071 04.31∗∗43.720 2167.034 52.46vanillic acid/isovanillic acid/4-hydroxy-2-methoxy-benzoic acidC8H8O4∗52.028 2180.066 02.18∗∗66.467 6241.118 31.73+72.477 4282.083 92.80Guanosine鸟苷C10H13N5O5+82.205 0292.139 72.48+912.213 2329.232 72.27∗∗107.712 3365.159 82.37∗117.292 8381.190 92.36∗1214.065 9452.277 34.37-134.788 6467.130 22.55∗∗1413.762 9476.276 21.56-1514.154 8480.308 33.92-1613.804 1504.308 31.56-177.677 4529.229 12.86∗∗1814.154 3540.329 03.68-1913.803 8564.330 11.77-2013.819 4614.330 22.49-2111.533 7719.363 81.82arvenin I/opercurins A三萜皂苷C38H56O13∗∗2211.995 4761.374 18.99∗2312.035 1763.389 33.65∗2411.993 6807.379 41.55∗

注：+表示瓤含有而皮中未检出；-表示瓤中未检出而皮含有；**表示瓤/皮>1，*表示瓤/皮<1，下同。

表4 栝楼瓤和栝楼仁的差异代谢物含量

续表4

表5 栝楼仁和栝楼皮的差异代谢物含量

3.2.3PCA分析及载荷矩阵 用Masslynx 4.1分析处理后。将其质荷比、保留时间和峰面积组成的三维矩阵导入Simca-P软件(13.0版本)进行下一步分析，结果见图4。

通过对栝楼3个不同部位(皮、瓤和仁)的代谢组学分析，可知栝楼不同部位的次生代谢产物有明显差别(见图4)，栝楼(N：瓤，P：皮)样品PCA分析图 PC1：74.6%，PC2：12.9%；栝楼(S：仁，N：瓤)样品PCA分析图 PC1：72.2%，PC2：16.8%；栝楼(S：仁，P：皮)样品PCA分析图PC1：68.9%，PC2：18.9%。这些差别在PCA分析载荷矩阵投影图也得以体现，主要是化学成分的相对含量存在差异。

4 讨论

本研究基于栝楼化学成分含量测定和代谢组学进行分析，研究结果表明：栝楼瓤中含有较高的3，29-二苯甲酰基栝楼仁三醇成分；其次，发现栝楼瓤中成分虽然与皮和仁差异较大，但也含有丰富的与皮、籽相同的成分；再则，系统地揭示出栝楼不同部位(皮、瓤和仁)化学成分的差异性，进一步为栝楼药理活性的研究奠定了理论基础，同时也对栝楼瓤的开发利用具有科学的指导意义。

本研究结果能够对栝楼中药资源利用予以启示，栝楼皮和栝楼仁作为2味药材在方剂中分开使用，其传统应用的功效不同，本实验结果也表明它们的化学成分和含量有所不同，功效不同可能与之有关。另外，栝楼瓤除作为全果一起药用外，生产基地把栝楼瓤作为废弃物弃之， 既浪费药用植物资源，又污染当地环境，栝楼瓤次生代谢产物与皮及仁中差异明显。栝楼果不同部位间的药理药效是否存在差异，栝楼瓤能否作为栝楼皮或栝楼仁药用的替代品，有待更多的学者深入研究。基于本研究的结果和相关文献记载，针对栝楼瓤的开发利用，建议重点考虑食品和化妆品[20-21]方向，特别是化妆品可能是优先考虑的，一方面栝楼(瓜蒌)在历史上有用于美白保肤的记载，另一方面主要是化妆品是外用产品，其安全性要求低于内服要求。

注：A.栝楼(N：瓤、P：皮)样品PCA分析图；B.栝楼(瓤、皮)PCA分析载荷矩阵投影图；C.栝楼(S：仁、N：瓤)样品PCA分析图；D.栝楼(仁、瓤)PCA分析载荷矩阵投影图；E.栝楼(S：仁、P：皮)样品PCA分析图；F.栝楼(仁、皮)PCA分析载荷矩阵投影图。图4 栝楼瓤、皮和仁不同部位间PCA分析图与其载荷矩阵投影图