单因素结合正交试验优选霍山铁皮石斛总黄酮工艺

2022-06-23贺增洋王国凯王文斌

安徽科技学院学报 2022年1期

刘瑾，汪洋，贺增洋，宁勇，王国凯，王文斌*

(1.皖南医学院药学院，安徽芜湖 230031；2.安徽中医药大学药学院，安徽合肥 230012；3.安徽中烟工业有限责任公司技术中心，安徽合肥 230012)

铁皮石斛(DendrodiumofficinaleKiumraetMigo)属于兰科石斛属,是一种十分贵重的药材,中医认为其具备润肺、养颜、滋阴、清热等功效。现代药理学研究表明,铁皮石斛具有促进消化、增强免疫、抗氧化、抗疲劳、降血压、降血糖等作用[1]。铁皮石斛种类繁多,主要分布在印度、中国、澳大利亚、日本等国家[2]。在我国,石斛种类有近八十余种[3],其中,可作为药用的石斛有三十多种[4]。

铁皮石斛对生长条件要求极其苛刻[5],在我国,铁皮石斛主要分布于浙江、广东、福建等一些温暖湿润的地区,由于过度开采,野生石斛资源已经十分稀少,现如今以人工栽培为主,以云南和浙江为第一组,广东和安徽为第二组,福建、江西等为第三组,以及四川和重庆为第四组的四个栽培组为主[6]。现代研究发现、免疫调节、抗肿瘤、以及血管扩张等一系列功能[7]为石斛的主要功能,临床研究表明,铁皮石斛对于特别是由于糖尿病、老年体制衰弱[8]、高血压[9]以及癌症放化疗[10-11]所引起的身体虚弱有着明显改善作用。铁皮石斛作为药食两用的药物，具有良好的药理活性[12-13],广泛应用于各种食品和保健品中,合理地开发利用铁皮石斛就显得十分重要。

黄酮类化合物作为最常见的多酚类物质,已发现的黄酮类化合物已有近万种。目前铁皮石斛中总黄酮的提取方法中,加热回流提取法、浸提、超声提取法、微波提取法以及酶解法[14-16]是石斛中黄酮的提取方法中常见的方法。本研究综合单因素结合正交试验设计优选霍山铁皮石斛总黄酮提取工艺。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试药与试剂芦丁标准品(武汉天植生物技术有限公司,批号:CFN98883,纯度>98%);霍山铁皮石斛药材由公司提供,药材经安徽中医药大学药学院杨青山老师鉴定为兰科植物铁皮石斛(DendrodiumofficinaleKiumraetMigo);甲醇、乙醇、三氯化铝、无水乙酸钠、冰醋酸等试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 KQ2200超声清洗机(昆山市超声仪有限公司);UV-8000紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司);AB135-S分析天平(Switzerland);TG16-W高速离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 显色剂与缓冲剂的配制精密称取2.68 g AlCl3,用80%的乙醇溶液溶解并定容至200 mL,得到0.1 mol/L的三氯化铝显色剂。精密称取无水乙酸钠5.44 g,用80%的乙醇溶液溶解并定容至200 mL,得到乙酸钠溶液;用移液管精密量取冰醋酸2.3 mL,用蒸馏水定容至200 mL;将上述两种溶液混合,得到CH3COONa-CH3COOH缓冲液。

1.2.2 对照品溶液的制备精密称取芦丁标准品10 mg置于50 mL容量瓶中,用80%的乙醇溶液溶解,定容,配成0.2 mg/mL的芦丁标准品乙醇溶液。

1.2.3 最佳波长的选择精密量取芦丁标准品溶液2 mL,用80%乙醇稀释至5 mL,分别加入缓冲液1 mL,显色剂2 mL,放置10 min,进行全波长扫描,确定最佳波长。

1.2.4 标准曲线的建立精密量取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于6个25 mL的容量瓶中,分别加80%乙醇至5 mL,再分别加入缓冲溶液1 mL,显色剂2 mL,最后再用80%乙醇定容至25 mL,放置10 min。在214 nm处测量吸光度,平行测量3次,建立标准曲线。

1.2.5 单因素试验依据相关研究资料[17-19],考察甲醇与乙醇两种不同溶剂对总黄酮提取率的影响,确定适宜的提取溶剂。研究各单因素试验时,保持基础条件不变,分别考察不同浓度的乙醇、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取率的影响。

1.2.6 正交与验证试验在1.2.5单因素试验考察的基础上,选择提取温度、料液比、提取时间、乙醇浓度为考察因素,因素水平见表1,采用正交表L9(34)进行正交试验设计,确定霍山铁皮石斛总黄酮的提取条件。根据正交试验的结果,进行验证试验。

表1 因素水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线

按照1.2.4操作方法建立标准曲线,如图1所示,得到标准曲线Y=50.017X-0.093 5,R2=0.999 8,符合线性关系。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 不同提取溶剂对总黄酮提取率的影响精密称取霍山铁皮石斛3份,每份1 g,置于100 mL具塞锥形瓶中,分别向其中加入50%甲醇溶液、50%乙醇溶液和蒸馏水50 mL,50℃超声提取70 min,离心,取上清液1 mL于25 mL容量瓶中,加80%乙醇稀释至5 mL,再分别加入1 mL缓冲液和2 mL显色剂,定容至25 mL,放置10 min后按1.2.4的方法测定含量,结果如图2所示,甲醇的提取率为2.46%,乙醇提取率为2.43%,考虑到甲醇的毒性较大,价格较乙醇较贵,故选择乙醇作为提取溶剂。

图1 芦丁标准曲线

图2 不同提取溶剂对总黄酮提取率的影响

2.3.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响精密称取药材7份,每份1 g,置于100 mL具塞锥形瓶中,分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液50 mL,50 ℃超声提取70 min,离心,再取上清液1 mL于25 mL容量瓶中,按1.2.4的方法测定含量,结果如图3所示,50%乙醇提取的总黄酮含量为2.44%,均高于其他浓度。