影响野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的相关因子研究

徐石兰 岑秀芬 韦鹏霄李 彬 黄家达 李祖潭

（广西大学农学院，南宁 530004）

野生毛葡萄是葡萄科葡萄属真葡萄亚属东亚种群的一个种，原产于中国。野生毛葡萄是广西原产的野生葡萄资源中分布最广、种类最多的一种［1］。我国野生葡萄分布有38种，占世界总葡萄种的60%，是野生葡萄资源最为丰富的国家［2］。孙马等人对中国野生葡萄18个种和64个株系的染色体进行了研究，发现中国野生葡萄全部为二倍体（2n＝38）［3］。野生葡萄营养丰富，至少含有17种氨基酸，其中7种为人体必需的氨基酸，总糖含量、氨基酸含量、VB2含量、K含量较高［4］，还含有丰富的花色素双糖苷、超氧化歧化酶及白藜芦醇等物质，具有软化血管、抗衰老、防癌的作用［4］。用野生葡萄酿造的野生葡萄酒，营养丰富，抗氧化活性和抗菌性高［5］。近些年来，国内有研究人员对野生葡萄的茎段、叶片、叶柄及单芽茎段等进行了离体培养研究［6］。刘伟对贵州成熟的毛葡萄种子用10%浓硫酸浸泡10min，萌芽率达100%［7］。到目前为止，还没有报道对野生毛葡萄种子进行单因子和多因子的灭菌处理以及用不同的方法处理野生毛葡萄种子探究萌芽特性。所以，本试验对广西柳城县野生毛葡萄种子的单因子和多因子的灭菌研究以及用不同方法处理野生毛葡萄种子探究萌芽特性，对野生毛葡萄离体繁殖和建立再生体系，对野生材料的大量繁殖、离体保存提高材料和技术支撑，为野生毛葡萄的遗传转化奠定理论和技术基础。

1 材料与方法

1．1 材料

试验材料为广西柳城县的野生毛葡萄种子，在2014年8月份葡萄成熟时采摘得到种子。

1．2 试验设计与方法

1．2．1 0．1%升汞不同灭菌时间的比较试验 本试验通过同一浓度（0．1%）的升汞对野生毛葡萄种子处理不同的时间来测定灭菌时间对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响。灭菌时间依次为10min、12min、14min、16min、18min共5个处理。

1．2．2 两种灭菌剂不同组合的比较试验 为了比较75%酒精和0．1%升汞的组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响，设计4个处理组，即先用75%酒精分别处理10s、20s、30s、40s，然后再用0．1%升汞处理16min。

1．2．3 三种灭菌剂不同组合的比较试验 为了比较75%酒精、不同浓度的升汞和次氯酸钠的不同组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响，设计4个处理：（1）75%酒精30s＋0．1%升汞16min＋0．12%升汞5min；（2）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋0．15%升汞 5min；（3）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋12%次氯酸钠 5min；（4）75%酒精30s＋0．1%升汞 16min＋15%次氯酸钠5min。

1．2．4 不同预处理方法的比较试验 为了比较温水、赤霉素预处理对野生毛葡萄种子污染率和发芽率的影响，试验设计如下：首先把野生毛葡萄种子放在冰箱在－4℃的低温条件下保存40d，然后进行3组处理，即（1）低温处理后不做任何处理；（2）低温处理后把种子置于40℃的无菌水中浸2h；（3）低温处理后把种子置于GA3 0．5mg/L（40℃）溶液中浸 2h。

以上各组试验的每个处理均接种野生毛葡萄种子60粒，设三次重复。诱导培养基为：MS＋6－BA1．0mg/L＋GA3 0．3mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂6g/L。培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度1500LX，光照时间12h/d。对试验数据采用SPSS方差分析软件进行统计分析。

2 结果和分析

2．1 0．1%升汞不同灭菌时间对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

表1 0.1%升汞不同灭菌时间对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

以0．1%升汞作单一灭菌剂，分别进行不同灭菌时间的对此试验，试验结果见表1。

由表1可知，0．1%升汞对野生毛葡萄种子的灭菌时间不同，灭菌效果不同，发芽率也不同。不同处理之间对种子的灭菌效果和发芽率的差异达到极显著水平。灭菌时间越长，种子的污染率越低。在0．1%升汞灭菌10－16min的时间范围内，种子污染率逐步降低，而种子的发芽率逐渐提高。从5个灭菌时间处理中，虽然18min处理的污染率最低，但发芽率也开始降低；16min处理的污染率虽不是最低，但是发芽率比其他几个处理都高，达到35%。综合灭菌效果和发芽率比较，以0．1%升汞灭菌16min的时间处理最佳。但是用升汞作单一灭菌剂，污染率仍较高，发芽率也较低，无法满足需要。

2．2 两种灭菌剂不同组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

以0．1%升汞16min与75%酒精不同灭菌时间组合进行比较，试验结果见表2。

表2 两种灭菌剂不同组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

由表2可知，0．1%升汞16min和75%酒精不同灭菌时间组合，对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响不同。不同处理之间对种子的灭菌效果的差异达到极显著差异水平，对发芽率的差异达到显著水平。随着75%酒精灭菌时间的增加，灭菌效果越好，种子的污染率越低。75%酒精灭菌时间从10－30s范围中，发芽率逐渐提高，但是到了灭菌时间40s，种子的发芽率反而下降。所以，综合比较试验结果，以75%酒精＋0．1%升汞16min两种灭菌剂组合表现最佳，野生毛葡萄种子的污染率为36%，发芽率为48．33%。

2．3 三种灭菌剂不同组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

以75%酒精30s＋0．1%升汞16min与不同浓度的升汞或者次氯酸钠的组合进行比较试验，试验结果见表3：

表3 三种灭菌剂组合对野生毛葡萄种子灭菌效果和发芽率的影响

由表3可知，以75%酒精＋0．1%升汞16min与不同浓度的升汞或次氯酸钠的组合不同，灭菌效果和发芽率也不同。不同处理之间对种子灭菌效果的差异达显著水平，对发芽率的差异达极显著水平。在75%酒精30s＋升汞16min前提下，在相同的5min灭菌时间处理时，0．12%升汞发芽率比0．15%升汞高，但是0．15%升汞的灭菌效果比0．12%升汞的灭菌效果好。在75%酒精30s＋0．1%升汞前提下，在相同的5min灭菌处理时，15%次氯酸钠比12%次氯酸钠的灭菌效果和发芽率都好，污染率为16．67%，发芽率为61．67%。综合试验比较结果，以75%酒精＋0．1%升汞16min＋15%次氯酸钠5min的三种灭菌剂组合效果最佳，野生毛葡萄种子的污染率为 16．67%，发芽率为 61．67%。

2．4 野生毛葡萄种子不同预处理对污染率和发芽率的效应

以常温（20℃）无菌水作为对照，进行40℃无菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）无菌溶液进行浸种试验，比较不同处理对种子发芽率的影响，试验结果见4。

由表4可知，对野生毛葡萄种子的预处理不同，种子的发芽率也不同。三个处理之间对野生毛葡萄种子发芽率的差异达到极显著水平。40℃无菌水浸种2h的发芽率比常温（20℃）无菌水浸种2h的发芽率高，达到66．67%；GA3 0．5mg/L（40℃）无菌溶液浸种2h的发芽率比40℃无菌水浸种2h发芽率高，达到73．33%。综合比较试验结果，以－4℃冰箱保存40d＋GA3 0．5mg/L（40℃）无菌溶液浸种2h为最佳野生毛葡萄种子的预处理方法。

表4 不同预处理对野生毛葡萄种子污染率和发芽率的效应

3 结果与讨论

升汞、75%酒精、次氯酸钠是组织培养中进行外植体消毒时常用的消毒剂。升汞中水解出来的Hg2＋离子可与带负电荷的蛋白质结合，使细菌蛋白变性，酶失活，达到消毒目的。75%酒精有很强的渗透力，能穿过细菌表面的膜，进入细菌内部，使构成细菌生命基础的蛋白质凝固，将细菌杀死。次氯酸钠是强氧化剂，利用其强氧化性能杀死病菌。

试验结果表明，在单一灭菌剂0．1%升汞的灭菌时间达到18min时，灭菌效果虽然最好，但是种子的发芽率却降低。根据升汞的灭菌原理可知，在灭菌时间延长时，Hg2＋与细菌蛋白质结合会更加彻底，灭菌效果就会更好，但是Hg2＋与种胚中蛋白质的结合机率也会加大，从而导致种胚失去活性，发芽率降低。因此，单一灭菌剂0．1%升汞对野生毛葡萄种子的适宜灭菌时间为16min。

在两种灭菌剂组合的75%酒精灭菌时间达到40s，虽然灭菌效果提升，但野生毛葡萄种子的发芽率却从灭菌30s时的48．33%下降到41．67%。由此可知，随着75%酒精灭菌时间越长，酒精对细菌细胞膜的穿透力和对种胚的穿透力就会增强，对细菌和种胚的破坏性就会增强。因此，在野生毛葡萄种子的灭菌处理中，0．1%升汞16min组合的75%酒精的适宜处理时间为30s。

野生毛葡萄种子的萌发首先要解除种子的休眠，根据甘阳英等人研究不同种源的葡萄种子休眠及其解除时发现，野生葡萄种子的休眠为生理休眠［8］。曾有研究证明，次氯酸钠能在一定程度上解除种子的休眠［9］。本试验结果表明，15%次氯酸钠处理5min的野生毛葡萄种子发芽率要比0．15%升汞处理5min的好。

用40℃无菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）无菌溶液浸泡进行预处理，对野生毛葡萄种子均能提高种子的发芽率，说明温水和赤霉素在一定程度上可以促进野生毛葡萄种子的萌发。傅强等人研究时发现，热水浸泡可以软化种皮，减少种皮表层的蜡质和油层，增强种皮的通透性，并且能浸出发芽抑制物［10］。赤霉素能诱导产生水解酶，使种子中的贮藏物质从大分子水解为小分子，如蛋白质水解为氨基酸、淀粉水解为糖，为胚所利用，促进胚后成熟，至于赤霉素促进野生毛葡萄种子萌发的适宜浓度，还有待进一步研究。

［1］邹瑜．野生毛葡萄种质资源及利用研究进展［J］．广西农业科学，2008，39（5）：664－667．

［2］AlleweldtG，Speigel－Roy P，Reisch B．Grapes（Vitis）［J］．Genetic Resourcesof Temperate Fruitand NutCrops290，1991：291－330．

［3］孙马，王跃进．中国野生葡萄染色体倍性研究［J］．西北农学学报，2006，15（6）：148－152．

［4］李玉鹏，黄燕，吴绍华．野葡萄营养成分的测定［J］．云南化工，2008，35（1）：50－51．

［5］繆冰旋．野生葡萄及葡萄酒抗氧化活性和抗菌性研究［D］．暨南大学，2014．

［6］张剑侠，王贺飞，徐炎，等．中国野生葡萄组织培养研究［J］．西北植物学报，2003，23（3）：460－463．

［7］刘伟．贵州葡萄属野生种快速繁殖及离体再生研究［D］．贵州大学，2010．

［8］甘阳英，李绍华，宋松泉，等．不同种源的葡萄种子休眠及其解除的研究［J］．生物多样性，2008，16（6）：570－577．

［9］比尤利．J．D，布莱克．M．种子萌发的生理生化，第二卷，生活力、休眠与环境控制［M］．南京：东南大学出版社，1989：48－152．

［10］傅强，杨期和，叶万辉．种子休眠的解除方法［J］．广西农业生物科学，2003，22（3）：230－234．