不同激素对甘草带芽茎段诱导丛生芽的影响

付 丽，张东向，刘安奇，吕 晴，李 伟

（齐齐哈尔大学生命科学与农林学院/抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

甘草（Glycurrihiza uralensisFisch.）为豆科甘草属多年生草本植物［1］，是最常用的药用植物资源之一，其根茎入药，具多种药理活性，有广泛的药用和商业价值［2］。近年来国内外市场对甘草的需求日益增加，甘草野生资源面临过度开采和枯竭的威胁［3］，质量和产量急剧下降，种质资源遭到严重破坏。随着科技的不断发展和应用，利用甘草组培技术进行快繁已有大量研究。汪连海等［4］采用不同激素配比的培养基，以甘草无菌苗茎尖为材料进行快繁研究，成功优化出增殖培养基，建立甘草快繁体系，甘草组织培养技术不仅有利于繁殖、增殖和保存，而且有利于诱导次级代谢产物的产生［5］，为甘草有效成分的提取奠定基础。而利用带芽茎段诱导丛生芽具有稳定的遗传性［6］，魏晓雪等［7］对野生兴安百里香进行快繁研究，证明带芽茎段为兴安百里香组培的最佳外植体，因此本试验采用甘草无菌苗的带芽茎段为材料，将无菌苗带芽茎段接种在不同激素含量的培养基中诱导丛生芽，通过测量植株株高、茎节段数、真叶片数及丛生芽的增值倍数等，以确定最佳的培养条件，研究最佳的植物激素浓度组合，确定甘草带芽茎段诱导丛生芽最佳培养基配方，以期为甘草快繁技术的应用提供理论指导及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

经专家鉴定为当年生甘草的无菌苗带芽茎段。

1.2 方法

本试验于2019年4月于齐齐哈尔大学生命科学与农林学院植物代谢生理研究室进行。

1.2.1 处理方法 在无菌条件下，选择正常生长20 d、茁壮、有节段的无菌苗，在超净工作台上用灭菌镊子取出，置于事先经高压灭菌干燥冷却后的滤纸上，用灭菌解剖刀和镊子取其带芽茎段0.7 cm，放入不同激素处理的培养基内，每瓶接种4个带芽茎段，封口后放入恒温培养箱内培养，温度为25℃，光照2 000 lx。

1.2.2 试验设计 根据培养基中6-BA、KT和NAA的浓度比进行单因素和组合因素设计相应适合丛生芽诱导的培养基。培养基中均加入30 g/L蔗糖、8 g/L琼脂，单因素设计：①MS+6-BA（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；②MS+KT（0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2）mg/L；组合因素设计如表1和表2所示，每组设置3个平行试验，每瓶25 mL培养基。

表1 不同浓度6-BA和KT组合设计

表2 不同激素组合试验设计

1.2.3 数据统计 接种20 d后观察带芽茎段诱导丛生芽及愈伤组织生长情况，按照下列方法计算丛生芽增值倍数和愈伤组织诱导率。

丛生芽增值倍数=分化出丛生芽个数/接种带芽茎段数量；愈伤组织诱导率=（形成的愈伤组织块数/接种外植体数）×100%。

2 结果与分析

2.1 6-BA对带芽茎段丛生芽诱导的影响

2.1.1 不同浓度6-BA对带芽茎段生长的影响 由表3可知，6-BA浓度为0.2和1.4 mg/L时均没有丛生芽产生；MS+1.8 mg/L 6-BA对带芽茎段株高影响最大，为（10.40±0.26）cm，与其他浓度存在极显著差异；MS+1.8 mg/L 6-BA的带芽茎段节段、节间距、真叶数分别为（5.67±1.15）节、（1.66±0.15）cm、（6.67±1.15）片，表明6-BA浓度为1.8 mg/L对甘草壮苗最为有利。

表3 不同浓度6-BA对甘草带芽茎段丛生芽生长的影响

2.1.2 不同浓度6-BA对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响 由表4可知，MS+0.2 mg/L 6-BA没有丛生芽产生；6-BA浓度为0.6 mg/L时，其丛生芽的增值倍数为2.67±0.53；MS+2.2 mg/L 6-BA丛生芽增值倍数为3.00±0.20，且每个丛生芽均有1～2片真叶，6-BA浓度在1.0～2.2 mg/L，随6-BA浓度的升高，甘草丛生芽的增值倍数升高。

表4 不同浓度6-BA对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响

2.1.3 不同浓度6-BA对带芽茎段愈伤组织形成的影响 不同浓度的6-BA对甘草带芽茎段诱导愈伤组织生长发育有一定影响，由表5可知，6-BA浓度在0.2和0.6 mg/L的培养基中，愈伤组织的生长状态良好且褐化率分别为11.11%和33.33%，6-BA浓度在1.0～2.2 mg/L褐化率 依次为33.33%、66.67%、44.44%、55.56%；随6-BA浓度的升高，愈伤组织有褐化趋势；但6-BA浓度在0.2～2.2 mg/L出愈率均达到100%。

表5 不同浓度6-BA对甘草带芽茎段诱导愈伤组织形成的影响

2.2 不同浓度KT对甘草带芽茎段丛生芽诱导的影响

如表6所示，在本试验所设的6个KT浓度下（0.2～2.2 mg/L）甘草带芽茎段均没有长丛生芽，但却有根和愈伤组织生成。表明不同浓度的KT对甘草带芽茎段生长发育影响较大，KT为2.2 mg/L时甘草带芽茎段植株高度达（9.30±1.35）cm，与其他浓度存在极显著差异；而且茎节数可达（4.75±0.71）个，与KT 1.4和1.0 mg/L存在极显著差异，和其他浓度之间没有显著差异；MS+2.2 mg/L KT真叶为（5.25±1.04）片，与KT 1.0 mg/L存在极显著差异，与其他浓度没有显著差异，说明KT不利于诱导丛生芽。

表6 不同浓度KT对甘草带芽茎段丛生芽诱导的影响

2.3 不同6-BA+KT组合对带芽茎段丛生芽诱导的影响

2.3.1 不同6-BA+KT组合对带芽茎段生长的影响不同浓度的6-BA+KT对甘草带芽茎段生长发育的影响见表7，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT对带芽茎段株高影响最大，株高可达（8.63±1.21）cm，茎节数也可达（4.67±0.58）个/株，同时，该组合还对提高真叶片数最为有利。但就促进节间伸长而言，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT的影响最大，可达为（1.90±0.23）cm。对愈伤组织诱导而言，0.9 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT最为有利，愈伤半径高达（0.37±0.13）cm，因此综合来看，0.3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L KT对甘草壮苗有利。

表7 不同浓度6-BA+KT组合对甘草带芽茎段丛生芽诱导的影响

2.3.2 不同6-BA+KT组合对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响 由表8可见，不同6-BA和KT配比对甘草带芽茎段诱导丛生芽生长发育具有一定影响，0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT对丛生芽增值倍数诱导最高，为（2.00±0.00）倍，与0.8 mg/L 6-BA+1.2 mg/L KT存在显著差异，与其他浓度无差异；对丛生芽高度诱导，为（2.78±0.37）cm；丛生芽节间距为（1.50±0.27）cm；诱导丛生芽真叶为（1.33±0.13）片，与其他浓度均无差异；说明0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT为诱导丛生芽的增值倍数较适合的浓度。

表8 不同6-BA+KT组合对甘草带芽茎段丛生芽形成的影响

2.3.3 不同6-BA+KT组合对带芽茎段愈伤组织形成的影响 由表9所示，不同浓度6-BA+KT对甘草带芽茎段愈伤组织形成具有显著影响，在6-BA+KT的5个组合中，虽然均能诱导出愈伤组织，但长势都不理想，愈伤组织大多都褐化趋于黑色，当带芽茎段接种到6-BA+KT组合培养基中，6 d左右带芽茎段底端膨大，出现水样化，愈伤组织有生长迹象，在13 d左右茎段底部有淡黄色水样化愈伤组织，连续培养16 d左右愈伤偏浅褐色，最后褐化甚至变黑色。

表9 不同浓度6-BA+KT组合对甘草带芽茎段愈伤组织形成的影响

2.4 不同激素组合对甘草丛生芽增值倍数的影响

由表10可知，不同浓度的6-BA、KT和NAA及其组合对甘草带芽茎段诱导丛生芽有影响且存在一定差异，综合上述试验，适合甘草带芽茎段丛生芽诱导的平均增值倍数（≥3）的激素组合为MS+2.2 mg/L 6-BA、MS+0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，其中MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT丛生芽的平均增值倍数达到（5.00±1.61）倍。

表10 不同激素组合对甘草丛生芽增值倍数的影响

3 讨论

试验把甘草带芽茎段分别接种在不同激素组合的培养基中，在诱导培养阶段发现，仅添加6-BA的培养基诱导率较高，适宜的6-BA浓度可显著促进丛生芽的形成，此结果与王效宇［8］在随6-BA浓度的升高，甘草丛生芽的增值倍数升高的结论一致。高浓度的6-BA对芽生长有抑制作用，与王非等［9］在6-BA浓度对褐毛铁线莲带芽茎段诱导丛生芽中，适宜的6-BA浓度促进褐毛铁线莲带芽茎段丛生芽的形成，高浓度对丛生芽生长有抑制作用的结果相一致。在仅添加KT的培养基中没有丛生芽的产生，但对带芽茎段的生长发育有显著影响。本试验在6-BA和KT组合中发现，随着KT浓度的逐渐升高，丛生芽增值倍数有下降趋势，与梁昊［10］在KT浓度升高对千层塔丛生苗生长有抑制影响，且较高浓度均会对丛生苗的生长产生抑制作用，甚至死亡的结论一致。在只有6-BA的培养基中愈伤有褐化情况，而当加入KT之后，随着浓度的增加愈伤组织不仅均趋于褐化而且出现黑色愈伤。进一步说明在6-BA与KT组合时，同时增加6-BA和KT的浓度对愈伤组织体积的状态没有很大的改变，但对愈伤组织的生长状况有抑制的趋势［11］。

大量研究表明，适宜的生长素和细胞分裂素组合可有效诱导植物外植体分化与生长，于红梅等［12］在以海沃德猕猴桃带芽茎段为外植体直接诱导丛生芽，建立快繁体系中发现，不同配比生长素与细胞分裂素对丛生芽诱导影响显著。试验发现不同激素组合对甘草带芽茎段诱导丛生芽生长有不同程度的影响，在甘草外植体诱导分化丛生芽的生长周期内，带芽茎段诱导丛生芽优化培养的适宜培养基是MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。茎段能否进行芽增值受到多种因素的影响，丛生芽增殖率高低很大程度上取决于一定范围内细胞分裂素与生长素的配比［13］，细胞分裂素水平增高，增进芽发育，易形成丛生芽。因此，在丛生芽的诱导过程中，细胞分裂素和生长素的配比是非常重要的［14］。