微生物源脂肽粗提物对克菌丹和代森锰锌增效活性

余 利, 王锦程, 谢亚杰, 黄伟东, 段海明

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

玉米大斑病是世界玉米种植产区广为发生的重大病害,在我国曾于20世纪70年代、90年代和21世纪初暴发流行,造成严重的经济损失[1]。随着品种的更新换代加速,加之大部分种质资源对大斑病表现为感,完全依靠抗病育种尚不能完全奏效,大斑病暴发流行的风险仍然较大[2]。目前,玉米大斑病的防治药剂包括丙森锌、代森铵、吡唑醚菌酯、枯草芽孢杆菌等单剂和吡唑醚菌酯与氟唑菌酰胺、戊唑醇、氟环唑、氯氟醚菌唑、稻瘟灵的复配剂以及戊唑醇和肟菌酯、丁香菌酯、丙环唑的复配剂为主[3]。玉米是我国三大种植作物之一,为确保玉米的高效生产和农产品质量安全,杀菌剂的使用面积较大,但是化学农药长期应用引起的环境污染、抗性与农产品安全等问题日益严重,化学药剂的减量控害技术已成为当今最为紧迫的研究热点之一[4-5]。筛选高活性的化合物和其它环境友好的防治措施替代是实现药剂减量化的重要手段,但筛选高活性化合物的难度大,生物防治还不能够适应种植环境的多样性而不稳定,物理防控手段难以在玉米田广泛使用[6]。本研究在前期筛选到一株对植物病原菌具有强抑制活性的生防菌株SJ06,对其所产脂肽类物质的抑制活性和化学杀菌剂的复配剂开展了相关研究,旨在为玉米大斑病的可持续防控和化学药剂的减施提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SJ06为安徽科技学院农学院实验室保存;供试化学杀菌剂克菌丹和代森锰锌分别由安徽锦江农化有限公司和山东先达农化股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 对峙培养法测定拮抗菌SJ06对玉米大斑病菌的抑制活性 对峙培养抑制活性采用菌饼五点法测定[7]。

1.2.2 不同稀释倍数脂肽对玉米大斑病菌的抑制活性测定 参照顾康博等[8]方法制备脂肽粗提物。分别采用滤纸片法和菌丝生长速率法测定脂肽粗提物对玉米大斑病菌的抑制活性[9]。滤纸片法测试浓度分别为脂肽原液和2倍、4倍、8倍和16倍稀释液,每个滤纸片(直径5 mm)上药剂加入量为10 μL。菌丝生长速率法测定脂肽粗提物的毒力,浓度设置为0.100、0.125、0.167、0.250、0.500 μL/mL;克菌丹浓度分别设置为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;代森锰锌浓度分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L。接种完毕后转入26 ℃恒温恒湿箱中培养96 h,采用十字交叉法测量菌落直径,采用SPSS 22.0软件求出EC50、毒力回归方程和R2。

1.2.3 Wadley公式法测定脂肽粗提物和化学杀菌剂的增效系数 脂肽粗提物与克菌丹以1∶100(质量比)的比例复配,复配浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L;脂肽粗提物与代森锰锌以1.5∶100的比例复配,复配浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mg/L;运用SPSS 22.0软件求出混剂的毒力回归方程、EC50,采用Wadley公式法求出增效系数(SR)[10]。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌SJ06对玉米大斑病菌的对峙培养结果

由图1可见，拮抗菌株SJ06和玉米大斑病菌在PDA平板上对峙培养96 h，可以发现对照已长满整个培养平板，而拮抗处理的玉米大斑病菌生长势较弱，具有明显的抑菌带。拮抗菌SJ06对玉米大斑病菌具有优异的抑制效果，抑制率达89.2%±0.46%。说明拮抗菌在PDA培养基生长过程中能够分泌对病菌抑制效果较强的抗生素或拮抗蛋白等活性代谢物质，活性物质以拮抗菌培养菌落为中心向周围扩散，玉米大斑病菌丝的生长受到活性物质抑制作用而生长速率减小。脂肽类抗生素是芽孢杆菌代谢物中较为重要的一类，下面以菌株SJ06产生的脂肽类抗生素开展抑菌活性研究。

2.2 不同稀释倍数脂肽粗提物对病菌的抑制活性

采用滤纸片法和菌丝生长速率法2种方法,测定不同稀释倍数的脂肽粗提液的抑菌活性。由表1可见,滤纸片法测定脂肽粗提物原液对玉米大斑病菌的抑制率达83.73%,稀释16倍对病菌的抑制率为59.64%,抑制效果优异。由表2可见,菌丝生长速率法测定得出,脂肽粗提物浓度从0.100 μL/mL增至0.500 μL/mL对玉米大斑病菌的抑制率分布在27.87%和71.03%之间,通过SPSS 22.0软件分析得出,脂肽粗提物对玉米大斑病菌的EC50达0.23 μL/mL,毒力回归方程为y=1.78x+1.15(R2=0.95)。

2.3 低剂量脂肽粗提物对克菌丹和代森锰锌抑制大斑病菌的促进效果

经SPSS 22.0软件分析得出,克菌丹对玉米大斑病菌的毒力回归方程为y=1.29x-0.98(R2=0.96),EC50为5.78 μg/mL;代森锰锌对病菌的毒力回归方程为y=1.78x-1.61(R2=0.95),EC50为8.04 μg/mL。脂肽粗提物和克菌丹质量比为1∶100下的毒力回归方程为y=1.41x-0.73(R2=0.96),EC50为3.27 μg/mL。经Wadley公式法计算得出其增效系数SR=1.78>1.50,表现为增效作用(表3、图2)。代森锰锌和脂肽粗提物质量比为100∶1.5时具有较强的增效效果,其毒力回归方程为y=1.02x-0.69(R2=0.95),EC50为4.68 μg/mL,增效系数SR为1.74>1.50,表现为增效作用(表4、图3)。

表3 脂肽粗提物和克菌丹复配(质量比1∶100)对玉米大斑病菌的抑制效果

图2 脂肽粗提物和克菌丹复配剂对玉米大斑病菌的抑制效果

表4 脂肽粗提物和代森锰锌复配(质量比1.5∶100)对玉米大斑病菌的抑制效果

克菌丹和代森锰锌同属有机硫类保护性杀菌剂，其中克菌丹对玉米大斑病菌的抑制效果要高于代森锰锌。研究发现，在脂肽类粗提物占比较低时，脂肽对上述2种杀菌剂具有协同增效作用尚不明确。脂肽类粗提物一般由表面活性素(surfaction)、丰原素(fengycin)和伊枯草菌素(iturin)等组成，至于何种脂肽类物质(或混合物)在增强克菌丹和代森锰锌的抑菌活性方面发挥主导作用，应开展脂肽类物质的分离纯化鉴定，并再次开展分离得到的单一活性脂肽成分和上述2种化学杀菌剂复配剂的抑菌效果评价，最终得到发挥主要协同抑菌活性作用的脂肽成分。

图3 脂肽粗提物和代森锰锌复配剂对玉米大斑病菌的抑制效果

3 结论与讨论

玉米大斑病主要为害叶片,造成光合效率下降,严重影响玉米产量和产品质量[11]。芽孢杆菌是一类防治植物病害的重要生防资源[12],其中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌等生防菌报道较多,主要以产生抗菌素、抗菌蛋白与脂肽类抗生素等方式发挥拮抗效应,产生的代谢物在病害生物防控中发挥了重要作用。脂肽粗提物可作为多种植物病菌的抑制剂,而且其对pH、温度和有机溶剂等外界条件表现较高的稳定性[13-14],但由于其固有属性,如产率低、分离纯化步骤繁琐等限制因素导致其开发应用成本较高,阻碍了脂肽粗提物作为农药登记而大规模使用的进度[15]。因此,研究脂肽低剂量下的使用技术对于降低药剂的使用成本,推动现有常见农药减施增效具有重要作用。王文桥等[16]报道枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BAB-1与不同农药进行交替喷施对番茄灰霉病的防效达86.90%,其防治效果明显高于单剂;刘晓妹等[17]研究表明,绝大多数的生防菌与化学药剂在防治芒果炭疽病方面具有协同作用。生防活体和化学药剂相互增效的决定因素其本质大多为菌株所产代谢物和化学杀菌剂由于作用靶标以及抑菌生理生化机制存在较大差异性,相互配合而起到增效作用[18]。本研究得出的脂肽粗提物和克菌丹、代森锰锌2种药剂的协同作用具有较大的利用价值。然而,考虑到田间防治效果与室内试验的环境条件存大较大差异性,其防效还有待田间试验进一步验证。

KIM等[19]研究表明,解淀粉芽孢杆菌JCK-12所产脂肽粗提物能够显著增强异菌脲、咯菌腈、苯菌灵、苯醚甲环唑、戊唑醇等对禾谷镰孢的抑菌效果,抑菌效果提升的原因是脂肽可致使细胞壁受到损害、细胞膜透性增大,最终导致病菌对药剂的吸收增强(或外排减少)。本研究通过药剂复配试验得出脂肽粗提物在占比较低的情况下对克菌丹、代森锰锌起到一定的杀菌提升效果,可以推测低剂量脂肽就能够增加玉米大斑病菌的细胞膜的透性,使更大量的克菌丹、代森锰锌药剂透过细胞膜而起到抑菌作用,从而在同等施药浓度下对玉米大斑病菌的抑制活性增强,达到化学药剂减施增效的目的。本研究的结果对于解淀粉芽孢杆菌SJ06产脂肽的下一步开发利用和上述2种化学药剂的减量使用均具有潜在利用价值。同时考虑到脂肽作为农药开发存在的难度和滞后性,可以尝试利用该菌株开发成为抗病功能肥料和化学药剂复配使用或间隔使用。