子宫内膜异位症中COX-2、MMP-14表达及与血清CA125的相关性

朱晓琴 钱 进 王永霞 马宗丽

江苏省如皋市人民医院(226500)

子宫内膜异位症(EMs)是育龄妇女的多发病、常见病，发病率达10%～15%[1]。研究其发生发展机制，有助于探寻早期诊断、靶向治疗与预后判断等标志物。环氧化酶-2(COX-2)与疾病病理过程中细胞的黏附、侵袭、血管生成具有直接或间接的作用[2]。李灿宇[3]等研究表明，COX-2在卵巢子宫内膜异位组织中表达水平升高，参与卵巢子宫内膜异位症的发生发展。基质金属蛋白酶-14(MMP-14)，在消化基底膜和细胞外基质、诱导癌细胞的迁移、促进肿瘤间质血管生成中起重要作用[4]。肖莉[5]等研究表明，MMP-14和血管内皮生长因子(VEGF)在子宫内膜样腺癌中表达升高，二者具有协同作用，参与了肿瘤性病变的形成和进展。目前COX-2与MMP-14在EMs研究报道不多。本研究检测COX-2、MMP-14在Ems组织中的表达情况，探讨与病情发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月-2020年3月在本院妇产科经腹腔镜手术及术后病理证实为EMs患者115例为EMs组，年龄(33.4±4.5)岁(20～48岁)。纳入标准：①术后经病理诊断为EMs且取在位内膜组织；②近3月内未服用对子宫内膜增殖有影响的药物或激素类药物。排除标准：①合并有其它内分泌疾病；②子宫发育异常；③恶性肿瘤史或免疫系统疾病；④临床资料不全。同期因子宫肌瘤行手术治疗并经病理证实子宫内膜无异常的50例为对照组，年龄(32.5±5.4)岁(22～50岁)。研究经本院伦理委员会批准。患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

鼠抗人COX-2单克隆抗体、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司，鼠抗人MMP-14多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化试剂盒、DAB试剂盒购自Santa Cruz公司，RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自于北京天根生化有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自于大连TAKARA公司，COX-2、MMP-14及GAPDH引物，由上海生工生物公司设计与合成。qRT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司。糖类抗原(CA125)检测试剂购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 COX-2、MMP-14 mRNA检测

1.3.1样品采集及保存术前取患者空腹静脉血抗凝取上清，检测CA125水平。术中取子宫内膜组织，一部分采用RNA提取试剂盒提取总RNA，检测RNA浓度与纯度，按照反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA，-20℃保存备用；另一部分加入福尔马林溶液浸泡固定，包埋后常温保存。

1.3.2实时荧光定量PCR检测总反应体系25μl。反应条件：95℃，120s；95℃，45s；65℃，45s；72℃，30s；40个循环。每个样品设置3个复孔。反应结束后，以GAPDH作为内参，计算COX-2、MMP-14 mRNA表达水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3免疫组织化学染色法检测将石蜡包埋组织切成4μm薄片，常规二甲苯脱蜡，经过高压热修复后，加3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶活性，加牛血清封闭，滴加鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人MMP-14多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜；再加羊抗鼠二抗，使用免疫组化试剂盒染色。最后染色，封片。显微镜下观察，采集图像。细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒为阴性。对每张切片任意选择5个高倍视野，观察阳性细胞表达强度并评分：无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。计算阳性细胞比例：<5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，76%～100%记4分；免疫组化最终评分为阳性率评分与强度评分相乘所得之积：0分为阴性(-)，1～3分为弱阳性(+)，4～6分为阳性(+ +)，>6分为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 内膜组织及血清指标水平比较

EMs组子宫内膜组织中COX-2、MMP-14 mRNA表达水平及血清CA125水平均高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组各指标检测水平比较

2.2 子宫内膜组织COX-2和MMP-14蛋白表达

免疫组织化学染色结果显示，EMs组COX-2、MMP-14阳性表达率均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 两组子宫内膜组织COX-2和MMP-14蛋白表达比较[例(%)]

2.3 EMs组COX-2、MMP-14表达与CA125水平相关性

相关性分析显示，EMs患者COX-2、MMP-14表达水平均与血清CA125呈正相关(r=0.619、0.515，均P<0.05)。

2.4 COX-2、MMP-14诊断EMs价值

COX-2预测EMs曲线下面积为0.832，截断值为1.28，敏感度为74.8%，特异性为82.0%；MMP-14预测EMs曲线下面积为0.889，截断值为1.37，敏感度为78.3%，特异度为88.0%；COX-2联合MMP-14预测EMs曲线下面积为0.913，敏感度为86.1%，特异度为86.0%。

3 讨论

EMs中70%～80%患者有不同程度的盆腔疼痛，40%～50%合并不孕，手术和药物是主要治疗手段，但存在不良反应多、复发率高等问题[6-7]。发病原因目前尚未明确，探究其发病机制有重要临床指导意义。

COX是前列腺素(PG)合成中重要的限速酶，被广泛认为是炎症过程中的重要诱导酶之一。研究显示COX-2基因在EMs在位内膜中表达增高[8]；COX-2 参与多种恶性肿瘤如胃癌等的发生发展，还有促进肿瘤血管生成并参与细胞的增殖、侵袭和转移[9]；刘斌[10]等研究表明，EMs患者COX-2 mRNA在异位内膜、在位内膜中均高表达；姚燕婷[11]等研究表明，EMs患者血清CA125与子宫内膜COX-2水平呈正相关性，且两指标联合检测对早期诊断EMs有较高价值。有研究报道，EMs患者在位和异位子宫内膜和卵巢子宫内膜异位组织中Cox-2 mRNA的表达显著增加，Cox-2 mRNA表达与血清CA125和子宫内膜瘤的直径显著相关[12]。本研究结果显示，COX-2在EMs组子宫内膜组织中mRNA表达水平与蛋白阳性表达率均高于对照组，提示COX-2可能与EMs的发生有关。MMP-14主要参与细胞外基质蛋白水解、外泌体运输以及细胞迁移和侵袭，特别是MMP-14对角膜新生血管形成具有促进作用[13]。有研究表明，在有活动性新血管形成的糖尿病视网膜病变患者中，MMP-14表达升高且与VEGF呈正相关[14]。本研究结果显示，与对照组比较，MMP-14在EMs组中高表达，提示MMP-14可能促进细胞增殖，与EMs发生发展有关。

目前EMs病因及发病机制不清，但多数学者认为异位内膜细胞的黏附、侵袭、血管生成是主要病理生理过程[15]。本研究结果显示，EMs组COX-2、MMP-14表达水平升高，可能与COX-2、MMP-14促进血管生成、参与细胞增殖与侵袭有关。虽然EMs为良性疾病，但也具有一些与肿瘤类似的生物学特性，如侵袭性和对正常组织的损伤性，且已有研究表明，EMs与卵巢癌发生发展有密切关系[16]。CA125普遍存在于子宫体腔上皮化生组织的细胞膜表面，有研究表明[17]，EMs患者血清中CA125升高，有助于临床诊断。本研究结果显示，EMs患者COX-2、MMP-14表达均与血清CA125水平呈正相关。进一步分析，COX-2、MMP-14联合预测EMs有较好诊断价值，提示COX-2、MMP-14对早期EMs诊断的指导意义。

综上所述，COX-2、MMP-14在EMs患者子宫内膜中高表达，与患者血清CA125水平相关，可能作为早期诊断EMs的分子标志物。但由于本研究临床样本数据少，仍需扩大样本量进一步验证结论。