人卵巢癌组织细胞中miR-134表达及与耐药的可能机制

刘新荣 刘永华 楚蔚琳

青岛市市立医院(266000)

卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中死亡率高，目前治疗方法以手术后化疗最为常见，而化疗药品中紫杉醇应用较为广泛[1]。近年研究发现，微小RNA(miRNA)可能作为一类新的癌基因或抑癌基因在肿瘤细胞的产生和生长过程中发挥重要作用[2]。由于miRNA可在翻译水平上抑制基因表达，参与细胞生长和分化，推测可能与癌细胞是否耐药存在相关性。为验证上述猜测，本研究通过基因检测技术检测卵巢癌细胞耐药与敏感的miRNA表达差异，并通过Western Blot方法对预测的靶基因表达进行验证，为提高卵巢癌的有效治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 标本获取及检测

选择2016年3月-2020年3月在本院治疗的卵巢癌患者病变标本。利用mirVanaTMRNA Isolation试剂盒(美国Ambion公司)提取 RNA。总RNA浓度、纯度和完整性的验证利用Agilent 2100 Bio analyzer系统自动分析。耐药与敏感细胞均使用1640培养基(10%FBS，青霉素100mg/L，链霉素100mg/L)，在30nmol/L紫杉醇条件下，使得SKOV3-TR30细胞维持耐药。在稳定的培养条件下获得对数生长期细胞进行下一步实验，培养环境设置为温度37.5℃、湿度饱和、5%CO2。

1.2 芯片杂交及数字化处理

将提取出的RNA通过添加多聚腺苷酸尾(polyA)与荧光标记链接，应用miRNA寡核苷酸基因芯片试剂盒(Affymetrix)进行芯片杂交。按照Gene Chip Hybridization Wash and Stain(Affymetrix)试剂盒，全自动洗脱染色工作站(Fluidics Station 450)进行染色。Affymeterix GeneChip Commond Console 1.1软件读取图像文件得到Cel原始数据；应用miRNA QC tool 处理得到txt标准化数据。与SKOV3相比，当比值>1时认为miRNA高表达，<1时低表达。采用Real-time PCR对芯片进行验证。

1.3 miRNA目标靶基因分析及其蛋白表达

为提高靶基因预测的准确性，利用4种生物学分析软件进行综合分析，筛选3种以上软件中有共同结果的基因作为靶基因，其中用到的生物学软件有Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets，采用方法为缺省设置综合分析。采用Realtime PCR进行靶基因表达检测，Western Blot方法验证靶基因蛋白表达。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 病例基本资料

紫杉醇耐药患者19例，年龄(55.7±6.8)岁，浆液性癌8例、黏液性癌7例、子宫内膜样癌4例，肿瘤分期I～Ⅱ期10例、Ⅲ～Ⅳ期9例；非紫杉醇耐药患者21例，年龄(54.8±5.9)岁，浆液性癌9例、黏液性癌8例、子宫内膜样癌3例，肿瘤分期I～Ⅱ期11例、Ⅲ～Ⅳ期10例。两组患者年龄、肿瘤类型、分期无差异(P>0.05)。

2.2 miRNA差异表达分析

经芯片杂交和数字化处理后分析结果可见，卵巢癌细胞紫杉醇耐药与敏感相比miR-17、miR-92-1、miR-1307等68个miRNAs高表达，miR-34、miR-134、miR-196b等101个基因低表达，其中miR-134基因与卵巢癌耐药相关性较大(P<0.05)。见表1。

表1 紫杉醇耐药与敏感卵巢癌细胞中miR-134表达情况比较

探针SKOV3TR30表达 P SKOV3表达 P 比值hasmiR37927.931370.2785161110.73871.94171E080.252hasmiR38213.151120.597778379.827531.94773E080.165hasmiR4093p21.578950.206733219.84611.03E060.098hasmiR4853p9.711260.85127530.263360.03917140.303hasmiR487a15.154960.495777561.732838.46275E070.241hasmiR487b37.231480.0214586154.33791.91373E080.241hasmiR6543p17.035850.398860145.967723.80035E050.372

2.2 紫杉醇耐药与非耐药患者标本miR-134表达

紫杉醇耐药患者标本miR-134表达水平(0.59±0.36)低于非耐药患者标本(1.28±0.47)(P<0.01)。

2.3 两种细胞中miR-134表达

将紫杉醇耐药的SKOV3-TR30细胞系中miR-134含量设定为1并作为对照组，以SKOV3细胞系中miR-134含量与之比较，得出SKOV3细胞中miR-134含量为1.343(P<0.05)。

2.4 miRNA靶基因检测

采用Target Scan、Pictar、miRanda和miR Base Targets 4个生物信息学分析软件综合分析，对miR-134基因进行靶基因预测。选取至少3种软件的共同结果作为靶基因，最终预测出miR-134的靶基因有c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等共128个。

2.5 miR-134靶基因蛋白表达

Western Blot方法检测，紫杉醇耐药的SKOV3-TR30细胞中c-Myc靶基因编码的蛋白较敏感的SKOV3细胞高表达(P<0.05)；Cdc42基因和MRPY基因编码的蛋白在耐药与非耐药细胞中表达无差异(P>0.05)。见图1、表2。

图1 SKOV3和SKOV3-TR30细胞c-Myc、BIM、PTEN蛋白的Western Blot结果

表2 各细胞系中靶基因蛋白的相对含量(相对灰度比值)

2.6 miR-134调控靶基因的表达

在紫杉醇耐药的SKOV3-TR30细胞(miR-134低表达)中过表达miR-134后，c-Myc基因表达下降，其编码蛋白也随之下降(P<0.05)，见图2a、2b；在非耐药的SKOV3细胞(miR-134高表达)中敲低miR-134表达后，c-Myc基因表达上升，其编码的蛋白也随之上升(P<0.05)。见图2c、2d。

图2 miR-134调控靶基因表达

3 讨论

3.1 miRNA概述

miRNA为非编码小RNA，通过转录后调控蛋白质表达，临床上可作为肿瘤诊断、治疗、预后判断及器官移植的生物标志物及治疗靶标[3]。随着研究的深入，人们对其功能的认识逐渐突破了肿瘤的局限，越来越多的疾病和组织中miRNA的表达及作用受到了学者们关注。miRNA首先在细胞核中由初级miRNA通过锚蛋白DGCR8或套索脱支酶作用形成前体miRNA，再由RNA酶III家族成员Dicer加工裂解为成熟双链miRNA，其中一条miRNA链通过与靶基因mRNA的3’UTR结合，从而降解或阻遏靶基因的翻译，使靶基因在细胞中差异性表达来发挥调控作用[4]。目前已知几百个miRNA调控人类30%以上的蛋白编码基因，通过降解目的基因表达调控信号传导，广泛参与人类机体多种生理病理过程[5]。

3.2 miRNA134与肿瘤关系

随着基因检测技术发展，基因水平的研究在癌症治疗中作用日渐突出。不断有研究证实miRNA参与影响了肿瘤细胞对化疗药物的敏感和耐药[6]。miRNA可在翻译水平上参与调控细胞生长和分化过程[7]。学者们通过两个发现找到了miRNA与恶性肿瘤的关系：一是miRNA定位在癌相关基因组区及基因组不稳定区域；二是miRNA在正常细胞和恶性肿瘤细胞中表达不同，几乎所有肿瘤存在miRNA表达异常[8]。目前发现的50%以上miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的基因组区，说明miRNAs在肿瘤发生过程中的重要作用[9]。

3.3 miR-134与卵巢癌细胞的耐药性

已有研究发现，miR-125、miR-182、miR-200等基因簇均可通过调控靶基因蛋白表达，影响卵巢癌细胞的耐药性[10]。Shuang T等[11]发现miR-134表达可影响卵巢癌细胞的耐药性，且通过调控pak2来实现，但其靶基因和具体调控机制未阐明。本研究在特殊培养基上培养并筛选出紫杉醇耐药(SKOV3-TR30)和敏感(SKOV3)的卵巢癌细胞系，通过miRNA芯片杂交技术筛选出两种细胞系间差异表达的miRNA基因谱，发现共有169个miRNA差异性表达，其中有68个miRNA较紫杉醇敏感的卵巢癌细胞表达上调，101个miRNA较之表达下调，其中miR-134表达下调最明显。通过测定紫杉醇耐药与非耐药患者标本miR-134表达水平发现，耐药组miR-134表达低于非耐药组。进一步通过人体组织标本验证了紫杉醇耐药卵巢癌细胞miR-134表达降低的结论。

本次研究发现，miR-134在敏感卵巢癌细胞中表达下调的基因有has-miR-134、has-miR-154、has-miR-299-3p、has-miR-376c、has-miR-379、has-miR-382、has-miR-409-3p、has-miR-485-3p、has-miR-487a、has-miR-487b、has-miR-654-3p，与Zhu H[12]等研究结果相似。综合分析，我们预测得c-Myc、MRPY/ABCC1、Cdc42等128个基因为潜在靶基因，而其中c-Myc已有研究证实定位于8q24.21，在卵巢癌组织中扩增率可达50%，被认为是确定的癌基因[13]。为了验证该预测潜在靶基因，本研究利用Western Blot方法检测c-Myc在两种细胞系中的蛋白表达，结果发现与敏感卵巢癌SKOV3细胞相比，耐药SKOV3-TR30细胞中c-Myc靶基因蛋白高表达。c-Myc基因是myc基因家族的重要成员之一，是一种可调节多种物质的基因，在细胞生长、分化及恶性转化过程中发挥作用。现已发现c-Myc基因在成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤中均出现扩增现象，且过量表达与肿瘤的早期复发联系密切[14]。在紫杉醇耐药的SKOV3-TR30细胞(miR-134低表达)中过表达miR-134后，c-Myc基因表达下降，其编码蛋白也随之下降；在非耐药的SKOV3细胞(miR-134高表达)中敲低miR-134表达后，c-Myc基因表达上升，其编码的蛋白也随之上升。与汤继英雄[15]等研究结果相符。说明miR-134影响卵巢癌细胞耐药机制可能是通过调节靶基因c-Myc来实现的。

综上所述，本文得出结论：miR-134在紫杉醇耐药卵巢癌细胞中较敏感癌细胞中低表达且影响耐药，机制可能是通过调节c-Myc蛋白潜在靶基因影响c-Myc蛋白的表达而产生耐药性。本课题组将继续以miR-134对c-Myc表达的调控为切入点，在基因层面探究卵巢癌发生发展及细胞耐药机制，为相关基因靶向治疗奠定理论基础。