首荟通便胶囊中7种成分测定及其提取工艺优化

马 云， 韩振明， 马 健， 张 微， 关永霞， 张贵民

(1.鲁南厚普制药有限公司，山东 临沂 276006；2.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276006；3.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276006)

首荟通便胶囊为鲁南厚普制药有限公司研发的中药6类新药，现已成功上市[1]，由何首乌、芦荟、决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实8味中药组成，以何首乌、芦荟为君药，决明子、枸杞子、阿胶为臣药，人参、白术为佐药，枳实为使药，临床上主要用于功能性便秘的治疗[2-3]，尤其对毒邪内蕴、阴液亏虚所致便秘具有良好的润肠通便作用，并具有排毒养颜、减肥降脂功效，适合老年人、体质虚弱者服用[4]。方中何首乌已分离出一百多种成分，其中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-葡萄糖苷显示出多种生物活性，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤、降脂、抗衰老等[5-8]，可作为该药材质量评价标志物[9-11]；芦荟中芦荟苷、芦荟大黄素等成分具有通便、抗炎、抗病毒、抗菌、保护肝脏和神经的多重活性[12-13]；决明子、枸杞子、阿胶、人参、白术、枳实所含成分具有调节消化系统[14]、保护胃肠道[15]、降脂[16]、保护心血管[17]、抗癌[18]、免疫调节[19-20]作用，在临床上达到协同治疗、共同起效的效果。

课题组前期对首荟通便胶囊相关物质基础进行文献调研，根据其药理活性及其物质基础的相关性分析结合指纹图谱[21]，采用响应面法优化该制剂提取工艺，HPLC法同时测定2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚的含量，以期为全面评价其质量奠定基础。

1 材料

1.1 试剂 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(CAS号82373-94-2，纯度≥98%)、柚皮苷(CAS号10236-47-2，纯度≥98%)、新橙皮苷(CAS号13241-33-3，纯度≥98%)、芦荟苷A(CAS号1415-73-2，纯度≥98%)、芦荟苷B(CAS号28317-16-6，纯度≥98%)、芦荟大黄素(CAS号481-72-1，纯度≥97%)、大黄酚(CAS号481-74-3，纯度≥98%)对照品均由上海源叶生物科技有限公司提供。乙腈、甲醇为色谱纯[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；异丙醇、磷酸为色谱纯，甲醇为分析纯(南京化学试剂股份有限公司)。

1.2 仪器 Waters高效液相色谱仪[配置Waters e2695四元泵、Waters 2998二极管阵列检测器、自动进样器，沃特世科技(上海)有限公司]；LE204E(十万分之一)、01193-YP601N(万分之一)电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；数控超声波清洗器(昆山洁力美超声仪器有限公司)；纯水/超纯水系统；有机滤头(0.22 μm，爱西默科技有限公司)。

1.3 药物 首荟通便胶囊由鲁南厚普制药有限公司提供，批号200101，生产时间为2020年1月。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液 取本品内容物适量，研细，精密称取0.5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声(250 W、100 Hz)处理60 min，放冷至室温，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，静置，吸取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2 对照品溶液 精密称取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚对照品适量，50%甲醇溶解并制成质量浓度分别为0.767 0、1.865、1.139、0.801 0、2.936 5、0.176 0、0.088 0 mg/mL的贮备液，取适量，稀释成每1 mL分别含七者0.076 7、0.186 5、0.113 9、0.080 1、0.587 3、0.017 6、0.008 8 mg的溶液，即得。

2.2 色谱条件 Agilent ZORBAX XDB C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长220 nm；进样量5 μL；理论塔板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，不得低于5 000。HPLC色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

1.2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 2. 柚皮苷 3. 新橙皮苷 4. 芦荟苷A 5. 芦荟苷B 6. 芦荟大黄素 7. 大黄酚图1 各成分HPLC色谱图

表2 各成分线性关系

2.3.2 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液适量，在“2.2”项色谱条件下进样测定6次，测得2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚峰面积RSD分别为1.41%、1.32%、1.32%、2.22%、0.74%、2.16%、1.35%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 精密称取本品(批号200101)内容物粉末6份，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚含量RSD分别为1.66%、0.67%、1.42%、1.94%、0.58%、1.86%、1.89%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 精密称取本品(批号200101)内容物粉末适量，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h在“2.2”项色谱条件下进样测定，测得2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚峰面积RSD分别为1.54%、1.08%、1.44%、1.43%、0.96%、1.82%、1.57%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品内容物粉末6份，精密加入对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚平均加样回收率分别为100.35%、98.81%、97.22%、98.40%、97.95%、98.95%、101.39%，RSD分别为1.99%、2.08%、1.30%、1.61%、0.46%、1.64%、1.90%。

2.4 提取工艺优化 采用Design-expert 8.0软件，设计3因素5水平响应面模型，选择甲醇体积分数(X1)、提取时间(X2)、料液比(X3)作为影响因素，各成分总峰面积(Y)作为评价指标，中心组合设计运行20次，设定显著性测试置信水平为95.0%(即P<0.05)，重复3次，因素水平见表3，结果见表4。

表3 因素水平

表4 试验设计与结果(n=3)

表5 方差分析

响应面分析见图2。由图2A可知，当提取时间一定时，随着甲醇体积分数增加，各成分总峰面积升高，但超过50%时开始降低；当甲醇体积分数一定时，随着提取时间延长各成分总峰面积变化不明显。由图2B可知，当料液比一定时，随着甲醇体积分数增加各成分总峰面积升高，在50%左右出现最高值，之后开始降低；当甲醇体积分数一定时，随着料液比增加各成分总峰面积升高，在1∶100左右出现最高值，之后基本稳定。由图2C可知，当提取时间一定时，随着料液比增加各成分总峰面积升高；当料液比一定时，随着提取时间延长各成分总峰面积升高程度缓慢。

注：左图为三维曲面图，右图为等高线图。图2 各因素响应面图

采用Design-expert 11.0软件进行分析，并结合实际操作情况，确定最优提取工艺为甲醇体积分数50%，提取时间60 min，料液比1∶100。再进行3批验证试验，测得各成分总峰面积为37 345 513，与预测值比较相对误差仅为0.47%，表明该工艺切实可行。

3 讨论

3.1 色谱条件筛选 芦荟苷A、芦荟苷B是同分异构体，两者可相互转化，并在一定条件下氧化分解，生成芦荟大黄素及其他成分[22]，前期报道中它们是统一按照芦荟苷进行含量计算[1]，但由于方法的不稳定性，经常存在肩峰或分叉峰情况，对色谱图积分的准确度造成影响。因此，本实验更改流动相有机相比例、pH值、洗脱梯度，发现在“2.2”项色谱条件下芦荟苷A、芦荟苷B分离度最好。

3.2 检测波长筛选 本实验对各成分进行全波长扫描，最终确定为220 nm。

3.3 柱温筛选 本实验考察了柱温25、30、35 ℃，发现在30 ℃下各成分色谱峰分离度理想，出峰时间适当。

4 结论

本实验建立HPLC法同时测定首荟通便胶囊中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、柚皮苷、新橙皮苷、芦荟苷A、芦荟苷B、芦荟大黄素、大黄酚的含量，并采用响应面法优化该制剂提取工艺，对提升其质量标准、推动相关规范化生产具有重要意义。