HPLC-DAD法同时测定金花清感颗粒中7种成分

2022-06-15曹洪杰夏方亮邵晓玮王玉林王建强王洪明

中成药 2022年5期

曹洪杰，夏方亮，邵晓玮，王玉林，王建强，王洪明

[1.滨州市食品药品检验检测中心，山东滨州 256600；2.滨州市化学药物研发与质量控制重点实验室(筹)，山东滨州 256600]

金花清感颗粒是在2009年首个抗击甲型H1N1流感的中成药[1]，而在2020年该制剂在治疗轻型、普通型新型冠状病毒肺炎方面疗效确切，退热时间缩短，轻症转重症比例降低[2-3]，被纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》试行第六版的推荐中成药[4]。该制剂用于治疗流行性感冒风热犯肺证，功效清热解毒、疏风宣肺，方中牛蒡子所含牛蒡苷具有明显的抗病毒作用，黄芩所含黄芩苷、汉黄芩苷具有抗菌、抗病毒、抗血栓作用[5]，苦杏仁所含苦杏仁苷具有降气、止咳、平喘作用[6]，知母所含芒果苷具有抗炎、降血糖、抗氧化、调节免疫等作用[7]，连翘所含连翘苷、连翘酯苷A等成分具有抗炎、抗病毒、抗菌等多种作用[8]。前期课题组查阅国内外文献发现，对金花清感颗粒的研究集中在流行性感冒[9-12]、新型冠状病毒肺炎的临床治疗[2]及药效物质基础[13-14]，尚无质量控制方面的报道，并且相关质量标准[15]仅涉及盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、牛蒡子苷、薄荷脑的含量控制，操作复杂。因此，本实验采用HPLC-DAD法同时测定金花清感颗粒中苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、汉黄芩苷的含量，旨在实现该制剂全面的质量控制。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司，精度0.01 mg)；KQ-300VDV 型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物黄芩苷(批号110715-201318，纯度93.3%)、汉黄芩苷(批号112002-201702，纯度98.5%)、芒果苷(批号11607-201704，纯度98.1%)、牛蒡苷(批号110819-201108，纯度94.6%)、连翘苷(批号110821-201816，纯度95.1%)、连翘苷A(批号111810-201103，纯度92.9%)、苦杏仁苷(批号110820-201808，纯度88.2%)对照品及金银花(批号121060-201608)、黄芩(批号120955-201810)、(草)麻黄(批号121051-201606)、甘草(批号120904-202021)、薄荷(批号120916-201812)、苦杏仁(批号121554-201204)、青蒿(批号121016-201506)、知母(批号121070-201806)、连翘(批号120908-201817)、浙贝母(批号120972-201906)、牛蒡子(批号120903-201811)对照药材均购自中国食品药品检定研究院。金花清感颗粒[聚协昌(北京)药业有限公司，批号20200218、20200228、20201005]购于康宇堂大药房。甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司)；磷酸为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备精密称取苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷对照品适量，甲醇溶解并稀释成质量浓度分别为0.885 5、0.536 6、1.904 4、0.946 1、1.013 8、1.007 5、1.009 6 mg/mL的贮备液，分别精密量取适量，置于同一10 mL 量瓶中，甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得(各成分质量浓度分别为35.421、10.732、19.044、75.685、10.138、102.168、20.193 μg/mL)。

2.2 供试品溶液制备取3包本品内容物，混匀，研细，精密称取1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加50%甲醇20 mL，称定质量，超声提取40 min，冷却，50%甲醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液5 mL，置于25 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液制备根据处方分别制备缺炒苦杏仁、缺黄芩、缺连翘、缺牛蒡子、缺知母的阴性样品，按“2.2”项下方法制备，即得。

2.4 色谱条件 Agilent XDB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～8 min，10%A；8～18 min，10%～14%A；18～35 min，14%～20%A；35～50 min，20%～32%A；50～60 min，32%～100%A；60～65 min，100%A；65～68 min，100%～10%A；68～78 min，10%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长207 nm(苦杏仁苷)、228 nm(芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、牛蒡苷、汉黄芩苷)；进样量10 μL。

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性考察取供试品、对照品、阴性样品溶液适量，在“2.4”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰与相邻峰之间的分离度均符合要求，理论塔板数均大于3 000，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

2.5.2 线性关系考察取“2.1”项下贮备液适量，50%甲醇制成每1 mL分别含苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷177.11、53.66、95.22、378.42、50.69、100.96、510.84 μg的对照品溶液，逐级稀释成系列质量浓度，分别精密吸取20 μL，在“2.4”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，并分别以信噪比10∶1、3∶1为定量限、检测限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

1.苦杏仁苷 2.芒果苷 3.连翘酯苷A 4.黄芩苷 5.连翘苷 6.牛蒡苷 7.汉黄芩苷1. amygdalin 2. mangferin 3. forsythoside A 4. baicalin 5. forsythin 6. arctiin 7. wogonoside图1 各成分HPLC-DAD色谱图Fig.1 HPLC-DAD chromatograms of various constituents

2.5.3 精密度试验取“2.1”项下对照品溶液，同一天在“2.4”项色谱条件下进样测定6次，计算日内精密度；每天测定2次，连续3 d，计算日间精密度，测得苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷两者分别为1.9%、2.0%；1.3%、2.1%；1.7%、1.8%；0.21%、0.5%；0.7%、0.8%；0.4%、0.4%；0.14%、0.26%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验取“2.2”项下同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷峰面积RSD分别为1.60%、1.55%、1.94%、0.32%、0.54%、0.61%、0.38%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

表1 各成分线性关系

2.5.5 重复性试验精密称取同一批本品(批号20200218)6份，每份0.5 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，测得苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷峰面积RSD分别为0.70%、0.18%、1.82%、2.14%、2.01%、1.66%、2.07%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验精密称取6份各成分含量已知的本品(批号20200218)0.5 g，加入适量对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，苦杏仁苷、芒果苷、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷、牛蒡苷平均加样回收率分别为98.36%、99.57%、99.24%、100.28%、99.33%、99.40%、99.85%，RSD分别为1.76%、0.58%、1.37%、0.83%、0.77%、1.17%、0.23%。

2.6 样品含量测定取3批本品，每批约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。