异甘草素纳米混悬剂的制备及其体内药动学研究

刘勇华， 张留超， 郭晓娜

(黄河科技学院，河南 郑州 450005)

异甘草素是从红血藤、肉豆蔻、甘草等植物根茎中提取得到的异黄酮类化合物，具有抗肿瘤、抗心律失常、抗炎、抗病毒、保肝、抗氧化等多种药理作用[1-2]，但该成分溶解度较差，从而影响其口服吸收[3]。目前，对异甘草素相关制剂的研究主要有脂质体[4]、聚乳酸纳米粒[5]、微乳[6]等，但存在制备过程繁琐、包封率和载药量低等缺点。

纳米混悬剂可有效提高药物溶出度和生物利用度[7-10]，与固体脂质纳米粒、聚合物纳米粒比较，具有制备工艺简单、载药量大等优势。马启珍等[11]采用磷脂作为稳定剂，制备了异甘草素纳米混悬剂，但磷脂在水相中稳定性较差[12]，也未进行冻干工艺研究，可能会存在稳定性问题；本实验采用沉淀-高压均质法制备异甘草素纳米混悬剂，并考察其体内药动学，以期为相关制剂研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ATS型高压均质机(加拿大SEEKER工业公司)；AR2140型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；M-sizer 2000型激光粒度分析仪(英国马尔文仪器有限公司)；Thermo Scientific 88882010型涡旋混合器(美国Thermo Scientific公司)；LHS-HC-I型恒温恒湿箱(上海一恒科学仪器有限公司)；SJIA-10N-50型冷冻干燥机(宁波市双嘉仪器有限公司)；ND400型氮气吹扫仪(杭州瑞诚仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 异甘草素对照品(批号191105，纯度98.2%，天津一方科技有限公司)；异甘草素原料药(批号P20191025T，纯度98.0%，武汉东康源科技有限公司)。聚乙烯吡咯烷酮K30(批号25000240379，亚什兰集团公司)；泊洛沙姆188(批号514621-3，德国BASF公司)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号181005，佛山市日特化工有限公司)。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，体质量(300±20)g，购于河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK(豫)2016-0001。

2 方法与结果

2.1 异甘草素含量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent Plus C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相0.2%磷酸-甲醇(55∶45)；体积流量1.0 mL/min；柱温35 ℃；检测波长372 nm。

2.1.2 线性关系考察 精密称取异甘草素对照品20 mg，溶于10 mL甲醇中，作为贮备液(2.0 mg/mL)；配制0.2%磷酸-甲醇(55∶45)混合溶液，超声处理10 min，作为稀释液，将贮备液稀释至50、5、0.5、0.1、0.05 μg/mL，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=1 201X-3.084 1(r=0.999 9)，在0.05～50 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 取1 mL纳米混悬剂至100 mL量瓶中，加入50 mL甲醇超声提取6 min，冷却至室温，稀释液定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取2 mL续滤液至10 mL量瓶中，稀释液定容，即得。

2.1.4 方法学考察 取同一份纳米混悬剂，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得异甘草素峰面积RSD为1.26%，表明该方法重复性良好。取同一份供试品溶液，室温下于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得异甘草素峰面积RSD为0.67%，表明溶液在48 h内稳定性良好。取同一份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得异甘草素峰面积RSD为0.22%，表明仪器精密度良好。取9份供试品溶液，分为3组，每组3份，分别加入2.5、5.0、7.5 mg对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得异甘草素平均加样回收率分别为100.38%、99.65%、99.80%，RSD分别为1.09%、0.73%、0.84%。

2.2 纳米混悬剂制备 采用沉淀-高压均质法。取0.5 g异甘草素原料药，加入40 mL无水乙醇，超声处理3 min溶解，作为有机相；取稳定剂(PVP K30和/或泊洛沙姆188)适量，加入100 mL蒸馏水，超声处理3 min溶解，作为水相，在转速800 r/min、温度50 ℃的磁力搅拌仪上将有机相缓慢滴加到水相中，滴完后继续搅拌3 h，在设定的均质压力下循环均质数次，蒸馏水定容至100 mL，即得。

2.3 单因素试验

2.3.1 稳定剂种类 固定异甘草素用量0.5 g，药物与稳定剂比例1∶3，均质压力100 MPa，均质次数8次，考察PVP K30、泊洛沙姆188、两者混合物(比例1∶2、1∶1、2∶1)对粒径、PDI的影响，结果见图1。由此可知，单用PVP K30或泊洛沙姆188时，粒径均超过230 nm，PDI均在0.2左右，相对较高；两者联用时，粒径、PDI均降低，其比例为1∶1时更明显。因此，选择PVP K30-泊洛沙姆188(1∶1)作为稳定剂。

图1 稳定剂种类对粒径、PDI的影响(n=3)Fig.1 Effects of stabilizer type on particle size and PDI (n=3)

2.3.2 药物与稳定剂比例 固定异甘草素用量0.5 g，PVP K30与泊洛沙姆188比例1∶1，均质压力100 MPa，均质次数12次，考察药物与稳定剂比例1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶5对粒径、PDI的影响，结果见图2。由此可知，随着药物与稳定剂比例增加，粒径呈先降后升的趋势，可能是由于过多的稳定剂附着在纳米粒周围，导致其粒径变大；PDI呈先降后趋稳的趋势，表明稳定剂用量增加有助于提高粒径分布的集中度，降低PDI。另外，药物与稳定剂比例为1∶3、1∶3.5时,两者粒径、PDI无明显差异，考虑到载药量，选择1∶3作为两者比例。

图2 药物与稳定剂比例对粒径、PDI的影响(n=3)Fig.2 Effects of drug-stabilizer ratio on particle size and PDI (n=3)

2.3.3 均质压力 固定异甘草素用量0.5 g，PVP K30与泊洛沙姆188比例1∶1，药物与稳定剂比例1∶3，均质次数12次，考察均质压力80、90、100、110、120 MPa对粒径、PDI的影响，结果见图3。由此可知，随着均质压力增加，粒径、PDI呈先降后升的趋势；在110 MPa时粒径较低，但PDI高于100 MPa时。由于在100、110 MPa下粒径无明显差异，故选择100 MPa作为均质压力。

图3 均质压力对粒径、PDI的影响(n=3)Fig.3 Effects of homogenization pressure on particle size and PDI (n=3)

2.3.4 均质次数 固定异甘草素用量0.5 g，PVP K30与泊洛沙姆188比例1∶1，药物与稳定剂比例1∶3，均质压力100 MPa，考察均质次数10、11、12、13、15次对粒径、PDI的影响，结果见图4。由此可知，均质次数过多时粒径、PDI反而升高，可能是加剧奥斯瓦尔德熟化作用所致[13]。因此，选择均质次数为12次，此时粒径、PDI均较低。

图4 均质次数对粒径、PDI的影响(n=3)Fig.4 Effects of homogenization frequency on particle size and PDI (n=3)

2.3.5 工艺确定 取0.5 g异甘草素原料药，加入40 mL无水乙醇，超声处理3 min溶解，作为有机相；取稳定剂[PVP K30-泊洛沙姆188(1∶1)]1.5 g，加入100 mL蒸馏水，超声处理3 min溶解，作为水相，在转速800 r/min、温度50 ℃的磁力搅拌仪上将有机相缓慢滴加到水相中，滴完后继续搅拌3 h，在100 MPa均质压力下循环均质12次，蒸馏水定容至100 mL，即得。

2.4 载药量测定 制备3批纳米混悬剂，分别精密量取1 mL，在-60 ℃下预冻2 d，置于-25 ℃冷冻干燥机中抽真空，静置2 d，称定粉末质量(W1)。取1 mL供试品溶液至100 mL量瓶中，加入50 mL甲醇超声提取6 min，静置至室温，稀释液定容，0.22 μm微孔滤膜过滤，取2 mL续滤液至10 mL量瓶中，稀释液定容，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算异甘草素含量(W2)，平行3次，计算载药量，公式为载药量=(W2/W1)×100%。结果，纳米混悬剂平均载药量为(24.36±0.83)%。

2.5 粒径、Zeta电位测定 取3份纳米混悬剂，每份0.5 mL，加入20 mL蒸馏水稀释，测定粒径、Zeta电位，结果见图5～6。由此可知，平均粒径、PDI、Zeta电位分别为(163.5±6.8)nm、0.109±0.12、(-34.1±2.6)mV，表明该工艺重复性良好。

图5 纳米混悬剂Zeta电位Fig.5 Zeta potential of nanosuspensions

图6 纳米混悬剂粒径分布Fig.6 Particle size distribution of nanosuspensions

2.6 形态观察 取纳米混悬剂0.5 mL，20 mL蒸馏水稀释后滴于铜网上，静置3 min，滤纸吸去多余液体，滴加1.5%磷钨酸，自然晾干，在透射电镜下观察其形态，结果见图7。由此可知，所得纳米混悬剂呈球形，无粘连现象。

图7 纳米混悬剂透射电镜图Fig.7 Transmission electron microscopic image for nanosuspensions

2.7 冻干粉制备和稳定性考察 取纳米混悬剂4 mL，加入5%乳糖-甘露醇(2∶3)混匀，在-60 ℃下预冻2 d，置于-25 ℃冷冻干燥机中抽真空，静置2 d，即得冻干粉。取适量(西林瓶密封)至恒温恒湿箱中，设置相对湿度为75%，温度为40 ℃，于1、3、6、9、15、18、21、30 d测定粒径、PDI，结果见表1，可知冻干粉放置30 d后粒径仍小于200 nm，PDI仍小于0.2，表明其稳定性良好。

表1 稳定性试验结果(n=3)

2.8 体外溶出度考察 配制1.5%十二烷基硫酸钠，超声处理10 min，作为溶出介质。取异甘草素、物理混合物冻干粉[取原料药适量，再按照处方比例称取辅料，蒸馏水将两者混匀，然后加入5%乳糖-甘露醇(2∶3)，在-60 ℃下预冻2 d后置于-25 ℃冷冻干燥机中抽真空，静置2 d，即得]、纳米混悬剂冻干粉适量(均过80目筛，异甘草素含量均为10 mg)，加入2 mL溶出介质振荡后置于透析袋中，两端扎紧，在溶出介质体积900 mL、温度(37±1)℃、转速100 r/min条件下于0、5、10、15、30、45、60、75、90、105、120、150、180 min各取样3 mL，补加1.5%十二烷基硫酸钠，保持总溶出介质体积不变，0.22 μm微孔滤膜过滤，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算累积溶出度，结果见图8。由此可知，异甘草素、物理混合物冻干粉在180 min内的累积溶出度分别为39.71%、51.94%，后者更高的原因可能与辅料增溶作用有关[14]；纳米混悬剂冻干粉在45 min内累积溶出度为90.37%，在60 min内基本溶出完全。

图8 异甘草素体外释放曲线(n=3)Fig.8 In vitro release curves for isoliquiritigenin (n=3)

2.9 体内药动学研究

2.9.1 分组与给药 取异甘草素、物理混合物冻干粉、异甘草素纳米混悬剂冻干粉适量，加入0.5%CMC-Na溶液使异甘草素质量浓度为10 mg/mL，作为灌胃药液。将18只大鼠随机分为异甘草素组、物理混合物冻干粉组、纳米混悬剂冻干粉组，每组6只，禁食过夜，按照50 mg/kg剂量灌胃给予相应药物，于0、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶静脉丛取血各约0.3 mL，置于肝素浸润离心管中，2 500 r/min离心2 min，取上层血浆，置于-10 ℃冰箱中。

2.9.2 内标溶液制备 称取苯甲酸钠对照品10 mg至100 mL量瓶中，甲醇溶解定容并稀释至200 ng/mL，即得。

2.9.3 血浆样品处理 取大鼠血浆、内标溶液各100 μL，置于具塞尖低离心管中，加入1.5 mL甲醇，涡旋5 min后5 000 r/min离心10 min，取上清液，40 ℃氮气缓慢吹干，加入100 μL甲醇复溶。

2.9.4 线性关系考察 取异甘草素对照品适量，甲醇制成质量浓度为1 800、900、600、200、100、20 ng/mL的溶液，精密量取100 μL，40 ℃氮气缓慢吹干，加入空白血浆、内标溶液各100 μL，置于具塞尖低离心管中，作为血浆对照品溶液，按“2.9.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定。以异甘草素、内标峰面积比值为纵坐标(Y)，异甘草素质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为Y=1.914 3X-0.587 6(r=0.993 5)，在20～1 800 ng/mL范围内线性关系良好。

2.9.5 方法学考察 取按“2.9.3”项下方法处理的血浆样品，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得异甘草素、内标峰面积比值的RSD为1.63%，表明仪器精密度良好。于0、4、8、12、24、48 h在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得异甘草素、内标峰面积比值的RSD为2.64%，表明样品在48 h内稳定性良好。取“2.9.4”项下100、600、900 ng/mL对照品溶液，制成血浆对照品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得异甘草素平均加样回收率分别为89.37%、94.175、90.86%， RSD分别为5.82%、3.19%、4.97%。取25 ng/mL血浆对照品溶液，空白血浆逐步稀释，按“2.9.3”项下方法处理，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，分别以S/N=3、S/N=10为检测限、定量限，测得两者分别为2.5、6.0 ng/mL。

2.9.6 体内药动学研究 异甘草素血药浓度-时间曲线见图9，其主要药动学参数见表2。由此可知，物理混合物、原料药tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞无显著差异(P>0.05)，表明前者促吸收作用较弱；与原料药、物理混合物比较，纳米混悬剂tmax缩短(P<0.01)，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高(P<0.01)，相对生物利用度增加至3.04倍。

3 讨论

为了得到稳定的异甘草素纳米混悬剂，选择合适的稳定剂至关重要，它可阻止纳米粒聚集，降低其碰撞几率，抑制其生长。课题组前期对聚山梨酯80、聚乙烯醇、磷脂进行了筛选，但所得纳米混悬剂的粒径或PDI较大，而磷脂存在稳定性问题，最终选择PVP K30、泊洛沙姆188作为稳定剂，其中泊洛沙姆188可吸附在纳米粒子表面，其分子链具有舒展性，能阻止纳米粒子在空间上彼此靠近[15]；PVP K30可置换粒子表面OH-或H2O，产生吸附层，降低表面自由能，并且其分子链具有延展性，有助于防止纳米粒子聚集[16]，同时，上述联合稳定剂也可提高溶出速率。

图9 异甘草素血药浓度-时间曲线(n=6)Fig.9 Plasma concentration-time curves for isoliquiritigenin (n=6)

表2 异甘草素主要药动学参数

药动学研究结果表明，异甘草素、物理混合物Cmax、AUC0～t有所提高，可能是稳定剂具有增溶作用而促进吸收，但差异无统计学意义(P>0.05)，而纳米混悬剂tmax显著缩短，可能是由于它在前30 min溶出速率较大，累积溶出度较高；Cmax、AUC0～t、AUC0～∞显著升高，相对生物利用度增加至3.04倍，可能是由于纳米药物容易附着在肠道黏膜[17]，并且它在伊派尔结中聚集，通过淋巴循循环进入血液循环而改变原料药吸收途径，使后者被高效吸收。