蒿竭通痹气雾剂制备工艺的优化

李 江， 张 希， 彭 霜， 郭媛媛， 杨 唯， 陈凌云， 李绍荣*， 余晓玲*

(1.昆明市中医医院，云南 昆明 650500；2.云南中医药大学，云南省高校外用给药系统与制剂技术研究重点实验室，云南 昆明 650500；3.普洱市民族传统医药研究所，云南 普洱 665000)

蒿竭通痹方由雪上一枝蒿、马钱子、龙血竭、红花、细辛组成，具有活血止痛、祛风散寒、除湿通痹、消肿通络之功效，用于治疗风寒湿热、淤血阻滞所致的关节疼痛，该方以白酒浸渍2周后制成酒剂，外用时以手涂抹药液，按摩患处，但方中雪上一枝蒿、马钱子毒性药材，使用时可能由于附着于手而随饮食入口，而且酒剂生产、保存、携带、运输、给药均存在不便。因此，本实验结合药味特性和临床需求，将蒿竭通痹方开发成携带方便、质量稳定的气雾剂，并对该制剂制备工艺进行优化，以期为其临床推广奠定基础，也为其他中药复方酒剂改制成气雾剂提供了新的方法和思路。

1 材料

安捷伦1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；CP124C电子天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司]。雪上一枝蒿甲素(批号110895-200404)、马钱子碱(批号110706-200505)、士的宁(批号110705-20030)对照品均购自中国食品药品检定研究院。雪上一枝蒿(批号X18041910)、马钱子(批号M18062001)、红花(批号H18030701)、细辛(批号XX18031401)、龙血竭(批号L18062006)均由昆明市中医医院提供，有检验合格报告。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 原料药含量测定

2.1.1.1 雪上一枝蒿甲素 精密称取80 ℃下干燥至恒重的对照品适量，甲醇制成100 μg/mL对照品溶液；取药材粉末约0.5 g，精密称定，加1 mL浓氨试液，密封，浸渍30 min，加25 mL甲醇，称定质量，超声提取1 h(53 kHz，100 W)，甲醇补足减失的质量，滤过，取10 mL续滤液，蒸干，甲醇溶解，定容至5 mL，作为供试品溶液。

色谱条件[1]为Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-[0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 ml/L磷酸二氢钾等量混合溶液(10%磷酸调节pH至2.8)](17∶83)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL，发现雪上一枝蒿甲素色谱峰与附近杂质峰分离度良好，理论塔板数不低于2 000。

以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得方程为Y=3.32X+2.66(r=0.999 7)，在16.50～264.00 μg/mL范围内线性关系良好。精密度试验中，雪上一枝蒿甲素峰面积RSD为0.79%(n=6)，表明仪器精密度良好。稳定性试验中，对照品、供试品溶液中雪上一枝蒿甲素峰面积RSD分别为0.80%、0.33%，表明溶液在0、4、8、12 h内稳定性良好。重复性试验中，雪上一枝蒿甲素含量RSD为1.22%(n=6)，表明该方法重复性良好。取6份雪上一枝蒿甲素含量已知(4.91 μg/mL)的同一批药材，加入281.00 μg/mL对照品溶液4 mL，制备供试品溶液，测得该成分平均加样回收率为101.19%，RSD为2.35%。取药材(批号X18041910)4份，测得雪上一枝蒿甲素平均含量为6.19 mg/g(RSD=0.13%)。

2.1.1.2 马钱子碱、士的宁 取药材(批号M18062001)4份，按2020年版《中国药典》方法测定，得马钱子碱、士的宁平均含量分别为19.26、20.59 mg/g，RSD分别为0.09%、0.18%。

2.1.2 提取液含量测定

2.1.2.1 溶液制备 精密称取雪上一枝蒿甲素(在80 ℃下干燥至恒重)、马钱子碱、士的宁对照品适量，甲醇制成质量浓度分别为100、200、200 μg/mL的对照品溶液。按处方比例取1/5量的药材共12 g，乙醇提取后合并醇提液，定容(提取1、2、3次时定容至500 mL，4次时定容至1 000 mL)，滤过，作为供试品溶液，同法分别制备缺雪上一枝蒿、缺马钱子的阴性样品溶液。

2.1.2.2 色谱条件与系统适用性试验 Diamonsil C18色谱柱；流动相乙腈(A)-[0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 ml/L磷酸二氢钾等量混合溶液(10%磷酸调节pH至2.8)](B)，梯度洗脱(0～13 min，16.5%A；13～15 min，16.5%～24.0%A)；体积流量1.3 mL/min；柱温40 ℃；检测波长210 nm(雪上一枝蒿甲素)、265 nm(马钱子碱)、255 nm(士的宁)；进样量10 μL，色谱图见图1。由此可知，各成分分离度良好(均不小于1.97)，理论塔板数按雪上一枝蒿甲素计不低于1 500，阴性无干扰。

1. 雪上一支蒿甲素 2. 马钱子碱 3. 士的宁1. bullatine A 2. brucine 3. strychnine图1 各成分HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2.3 方法学考察 取对照品溶液2.5 mL(雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁质量浓度分别为238.40、464.92、459.39 μg/mL)，甲醇定容至5 mL，取2.5 mL，甲醇定容至5 mL，按上述比例反复稀释，在“2.1.2.2”项色谱条件下进样测定，以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，得雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁方程分别为Y=17.16X+31.60(r=0.999 9)、Y=8.30X+22.24(r=0.999 9)、Y=3.62X+10.81(r=0.999 4)，分别在14.90～238.40、29.06～464.92、28.72～459.39 μg/mL范围内线性关系良好。精密度试验中，3种成分峰面积RSD分别为1.64%，1.69%，0.64%(n=6)，表明仪器精密度良好。稳定性试验中，对照品溶液中3种成分峰面积RSD分别为1.68%、1.16%、0.88%，供试品溶液中分别为1.55%、0.50%、0.87%，表明溶液在0、4、8、12 h内稳定性良好。重复性试验中，3种成分含量RSD分别为2.02%、2.20%、1.45%(n=6)，表明该方法重复性良好。取6份3种成分含量已知(分别为33.48、103.97、102.56 μg/mL)同一批提取液，加入对照品溶液(3种成分质量浓度分别200.20、630.83、431.26 μg/mL)1 mL，按“2.1.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.2.2”项色谱条件下进样测定，测得3种成分平均加样回收率分别为96.78%、100.31%、98.52%，RSD分别为1.94%、2.54%、2.34%。

2.1.3 单因素试验

2.1.3.1 转移率、综合评分 以雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁转移率及浸膏得率为评价指标[2]，进行单因素试验，计算公式为转移率=(1 g药材提取液中相应成分含量/1 g药材中相应成分含量)×100%[3]，再计算综合评分Z1，公式为Z1=[(雪上一枝蒿甲素转移率/最大值)×0.25+(马钱子碱转移率/最大值)×0.25+(士的宁转移率/最大值)×0.25+(干膏得率/最大值)×0.25]×100。

2.1.3.2 粉碎粒径、提取方法、乙醇体积分数 参考文献[4]报道，采用单因素试验对粉碎粒径(饮片、80%过1号筛同时过2号筛的不超过30%、80%过4号筛同时过6号筛的不超过30%)、提取方法[固定乙醇体积分数为55%，回流提取条件为提取3次，第1次料液比1∶10提取3 h，第2次料液比1∶8提取2 h，第3次料液比1∶5提取1 h；超声提取条件为53 kHz、100 W提取2次，料液比1∶10，提取时间1 h；浸渍提取条件为浸渍3次，料液比1∶8，浸渍时间1周；渗漉提取条件为料液比1∶8浸渍12 h后按1∶15比例渗漉提取，体积流量0.25 mL/(12 g·min)]、乙醇体积分数(35%、45%、55%、65%、75%)进行考察。结果，筛选出最优粉碎粒径为80%过1号筛同时过2号筛的不超过30%，提取方法为回流提取，乙醇体积分数为55%。

2.1.3.3 浸泡时间、吸液量 组方药材按“2.1.3.2”项下规格粉碎，称取6份，每份12 g，55%乙醇(料液比1∶10)浸渍，每15 min取1份样品，滤尽浸渍液，称定药渣质量，平行操作2次，测得最佳吸液量为(64.52±1.90)%，浸泡时间为60 min。吸液量计算公式为吸液量=(浸渍后药渣质量/浸渍前药渣质量)×100%。

2.1.3.4 料液比、提取时间、提取次数 采用单因素试验对料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16)、提取时间(20、40、60、80、100 min)、提取次数(1、2、3)进行考察。结果，最优料液比为1∶12，提取时间为60 min，提取次数为2次。

2.1.4 AHP-CRITIC法结合Box-Behnken设计

2.1.4.3 AHP-CRITIC混合加权法 按公式Wf=Wj-AHPWj-CRITIC/∑Wj-AHPWj-CRITIC，计算雪上一枝蒿甲素转移率、马钱子碱转移率、士的宁转移率、浸膏得率复合权重系数(Wf)测得四者分别为0.155、0.286、0.336、0.223。采用SPSS 18.0软件对AHP与CRITIC的复合权重系数进行相关性分析，测得相关系数为-0.969，表明2种赋权方法存在较大差异，无叠加性。再对Box-Behnken设计中AHP、CRITIC、AHP- CRITIC法所得综合评分进行相关性分析，发现AHP与CRITIC、AHP与AHP-CRITIC、CRITIC与AHP-CRITIC的相关系数分别为0.960、0.997、0.977，表明3种赋权方法具有一致性，所得复合权重系数可靠。

表1 CRITIC法计算各指标相关参数

表2 Box-Behnken设计结果

2.1.5 验证试验 采用小试工艺规模，取标准处方量药材共100 g，按“2.1.4”项下优化工艺进行3批验证试验。测得平均综合评分为102.97分(RSD=3.47%)，与预测值99.28分接近(相对误差为3.72%)，表明该工艺稳定可靠。

2.2 浓缩工艺优化 以雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁保留率为评价指标，采用单因素试验优化浓缩工艺。结果，最优工艺为先在(65±5)℃、(0.06±0.01)MPa下将提取液浓缩至1 mL/0.1 g原药材，再在常压下浓缩至1 g/3 g原药材，各成分平均保留率为79.94%(n=2)。

2.3 成型工艺优化

2.3.1 单因素试验 以雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁保留率为评价指标，对乙醇体积分数(70%、80%、85%、90%、95%)进行考察，确定为90%乙醇。参考文献[13]报道，以沉淀、分层、抛射剂与药液相溶性，喷射状态为评价指标，对抛射剂种类及用量(固定药液30 mL，分别与15、21、27、33 g四氟乙烷、丙丁烷、异丁烷构成12个组合)，附加剂种类及用量(固定药液30 mL，组合见表3)进行考察，确定为丙丁烷用量为21～27 g，甘油用量为3 g，丙二醇用量为1～1.5 g。

2.3.2 正交试验 在单因素试验基础上，以丙丁烷用量(A2)、甘油用量(B2)、丙二醇用量(C2)为影响因素，评价指标见表4，采用正交试验作进一步优化，结果见表5，最终确定最优工艺为药液用量30 mL，丙丁烷用量21 g，甘油用量3 g，丙二醇用量1.5 g，综合评分为95分，方差分析见表6，可知丙丁烷用量有显著影响(P<0.05)。再按上述优化工艺进行3批验证试验[14]，测得平均综合评分为94分，与预测值95分接近，表明该工艺稳定可靠。

表3 成型工艺单因素试验水平

表4 成型工艺评分标准

表5 正交试验设计与结果

表6 方差分析

3 讨论

课题组前期对蒿竭通痹方中雪上一枝蒿、马钱子2味君药和贵细药材龙血竭(不参与提取，在配液时用95%乙醇溶解后与其余药材提取物混合)进行质量标准研究，并起草了相关草案。为了保障制备工艺研究的可靠性，本实验所用药材均为同一批次，并且均符合上述要求。

在提取工艺优化过程中，本实验选择雪上一枝蒿甲素、马钱子碱、士的宁转移率作为评价指标，这3种成分均具有抗炎、抗菌、镇痛功效[15-16]，与蒿竭通痹方临床适应症相关；原方采用白酒浸渍后入药，故直接选择乙醇作为提取溶剂；浸膏得率作为另1个评价指标，由于在单因素试验中无法计算混合权重系数，故上述4个指标的权重系数均设为0.25。再采用AHP-CRITIC混合加权法进行赋权，该方法与单一的Delphi赋权、AHP赋权、CRITIC赋权比较具有更高的可靠性。

在成型工艺优化过程中，本实验以沉淀、分层情况为主要评价指标，同时结合2020年版《中国药典》四部通则0113对于非定量外用气雾剂的要求，选择喷射速率、喷出总量、内压作为次要评价指标，并对上述指标的得分标准进行具体划分，再结合正交设验，可使所选处方更合理。

综上所述，AHP-CRITIC混合加权法结合Box-Behnken试验可使蒿竭通痹方提取工艺研究更合理，而在该方成型工艺优化过程中评分标准结合正交试验能更高效可靠地筛选处方。