小绿叶止咳糖浆主要化合物鉴定及药物移行成分分析

刘匡一， 熊国营， 苏 丹

(1.南昌市第一医院药剂科，江西 南昌 330000；2.江西中医药大学抑郁症中医证候动物模型江西省中医药管理局重点研究室，江西 南昌 330000)

小绿叶止咳糖浆是德国Engelhard公司开发出的纯天然药物，主要成分是常春藤叶干提取物，用于缓解小儿感冒等各种病因引起的咳嗽和咽喉肿胀，能有效对抗可能转化的严重支气管炎，其疗效在临床上得到肯定。但课题组前期查阅国内外相关资料及说明书，未见对小绿叶止咳糖浆中常春藤叶提取物主要成分的报道，而该制剂成分组成的不确定性会严重制约其临床应用。同时，标志性活性成分的确定作为中药质量控制的核心环节和基础，贯穿了整个质量传递体系[1]，故寻找小绿叶止咳糖浆主要成分显得更为重要。

研究表明，常春藤属植物的种类较多，在全世界共有14种，大多以生长地区来命名，如加纳利常春藤、英国常春藤、中华常春藤、台湾常春藤等[2]，目前对小绿叶止咳糖浆中常春藤的种属未知，主要成分可能为皂苷、黄酮等[3-4]。本实验采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-QTOF/MS)仪中的Swath采集技术[5-7]，鉴定小绿叶止咳糖浆中主要化合物，并分析该制剂药物移行成分，以期为其物质基础研究提供依据，也为后续相关质量评价与控制奠定基础[8]。

1 材料

1.1 仪器 超高效液相色谱系统(日本岛津公司)；SCIEX 6600+四极杆飞行时间质谱仪(美国SCIEX公司)；TC-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；VORTEX-6涡旋混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；AL104电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DCY-24S恒温氮气吹干仪(青岛海科仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 木犀草苷(批号111720-201307，纯度≥94.0%)、槲皮苷(批号111538-200301，纯度≥94.5%)、绿原酸(批号110753-201415，纯度≥96.2%)对照品均购于中国食品药品检定研究院；白头翁皂苷B4(批号Z01M8S30248，纯度≥98.0%)对照品购于上海源叶生物科技有限公司。小绿叶止咳糖浆(批号19F059A)购于网络平台天猫国际自营店。甲醇、乙腈为色谱纯，均购于美国Thermo Fisher公司；甲酸为色谱纯，购于美国Sigma公司；水为屈臣氏蒸馏水。

1.3 动物 SPF级雄性SD大鼠6只，体质量(180±20)g，购自江西中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号SCXK(赣)2018-003。

2 方法

2.1 供试品溶液、药液制备 取1 mL本品，转移至5 mL量瓶中，50%乙腈定容至刻度，超声提取30 min，50%乙腈补足减失的质量，16 000 r/min离心10 min，取上清液，即得供试品溶液。取100 mL至蒸发皿中，60 ℃水浴蒸干至10 mL左右，即得药液，在4 ℃下冷藏保存。

2.2 对照品溶液制备 取木犀草苷、槲皮苷、绿原酸、白头翁皂苷B4对照品适量，乙腈溶解稀释，即得(质量浓度为1 mg/mL)，在4 ℃下冷藏保存。

2.3 分组与给药 6只大鼠正常喂养1周，给药前禁食12 h，自由饮水，随机分为空白组、给药组，每组3只，空白组大鼠灌胃给予2 mL生理盐水，给药组大鼠灌胃给予2 mL“2.1”项下药液，于0、0.5、1、2、4 h眼眶取血各0.5 mL左右，置于肝素钠抗凝处理的离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液，在-20 ℃下保存，4 h后取大鼠肺部组织，生理盐水冲洗，洗净后加入2倍量生理盐水，置于匀浆机上匀浆后4 000 r/min离心5 min，取上清液，在-20 ℃下保存。

2.4 血浆、肺组织处理 取大鼠血浆、肺组织匀浆上清液各200 μL，600 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋振荡2 min，16 000 r/min离心10 min，取上清液，室温氮气恒流吹干，200 μL乙腈复溶。

2.5 色谱条件 Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流动相正离子模式0.05%甲酸(A)-乙腈(B)，负离子模式水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～1.5 min，5%B；1.5～5 min，5%～20%B；5～15 min，20%～40%B；15～35 min，40%～65%B；35～39 min，65%～90%B；39～42 min，90%B；42～42.1 min，90%～5%B;42.1～47 min，5%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.6 质谱条件 SCIEX Triple TOF 6600+质谱仪；电喷雾离子源，正负离子扫描模式；正离子电压5 500 V，负离子电压-4 500 V；Gas 1/Gas 2 50 psi(1 psi=6.895 kPa)；Cur Gas 35 psi；一级TOF MS扫描范围m/z100～1 500，DP 60 V；二级采用Swath MS/MS非数据依赖型模式进行数据采集，正离子模式下碰撞能量45 V，负离子模式下碰撞能量55 V，MS/MS扫描范围m/z50～1 500。整体扫描模式中的数据采集在动态背景扣除模式下运行。

2.7 数据处理 通过SCIEX OS 2.0软件进行处理，分析样品色谱图信息，鉴定主要化合物和药物移行成分。

3 结果

3.1 主要化合物 UPLC-QTOF/MS总离子流图见图1，通过对照品比对确定木犀草苷、槲皮苷、绿原酸、白头翁B4皂苷出峰情况，并通过数据库和文献[9-24]，结合天然产物质谱裂解规律鉴定出62个主要化合物，包括酚苷、植物激素各1个，萜类3个，氨基酸、有机酸各5个，香豆素3个，黄酮7个，皂苷34个，具体见表1。

图1 小绿叶止咳糖浆UPLC-QTOF/MS总离子流图Fig.1 UPLC-QTOF/MS total ion current chromatograms of Prospan Hustenliquid Cough Syrup

3.2 酚苷结构解析 本实验鉴定出的酚苷为根皮酚(-β-D-葡萄糖苷)，正离子扫描模式下在保留时间3.88 min处存在一级母离子m/z289.092 1[M+H]+、二级碎片离子m/z127.039 6[M-C6H11O5+H]+，并且m/z109.025 1为m/z127.039 6[M-C6H11O5+H]+再掉一分子水所致。

3.3 有机酸结构解析 本实验共鉴定出5种有机酸，在负离子检测模式下分别为保留时间1.05、4.56、5.56、5.76、25.88 min处的奎宁酸(m/z191.055 7[M-H]-)、新绿原酸(m/z353.087 3[M-H]-)、绿原酸(m/z353.087 2[M-H]-)、隐绿原酸(m/z353.087 7[M-H]-)、lyofolic acid(m/z693.418 8[M-H]-)。通过对照品比对确定绿原酸保留时间，并且新绿原酸、隐绿原酸与绿原酸互为同分异构体，再比较三者logP，确定其出峰顺序为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸，以新绿原酸为例，其裂解途径见图2。

3.4 香豆素结构解析 结合天然产物裂解规律和数据信息，本实验在正离子扫描模式下鉴定出3种香豆素，分别为保留时间4.83、5.99、6.42 min处的秦皮甲素(m/z341.086 2[M+H]+)、秦皮乙素(m/z179.034 0[M+H]+)、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃半乳糖苷(m/z339.107 1[M+H]+)。以4-甲基伞形酮-α-D-吡喃半乳糖苷为例，其一级离子中母离子以m/z339.107 1[M+H]+模式存在，二级碎片m/z147.044 1为一级母离子脱去一分子葡萄糖基、一分子水、一分子甲基所致。另外，秦皮甲素二级碎片中m/z179.033 9为[M-C6H11O5+H]+所得。

注：虚线为断键方式。图2 新绿原酸二级质谱图及裂解途径Fig.2 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for neochlorogenic acid

3.5 黄酮结构解析 通过文献检索和天然产物裂解规律，结合数据处理软件中的Formula Finder确证方式，在正离子扫描模式下鉴定出以[M+H]+模式存在的槲皮苷、金丝桃苷、桑色素、芦丁、3,3′,4′,7-四羟基黄酮、木犀草苷(对照品比对)、山柰酚-3-O-芸香糖苷。在常春藤属植物中，黄酮一般有带有糖基类基团，故其二级碎片中都存在失去糖基的二级离子，例如保留时间8.50 min处的m/z449.105 8[M+H]+槲皮苷二级离子中含m/z287.055 0[M-C6H11O5+H]+的掉糖基碎片离子，金丝桃苷二级碎片离子包括失去一分子葡萄糖基的m/z303.049 9及经RDA等裂解反应得到的m/z85.028 4碎片离子。综上所述，药液中黄酮普遍存在RDA裂解反应，m/z303.049 9、85.028 4的碎片离子是芦丁、金丝桃苷共有特征碎片离子，而m/z153.018 1是桑色素、3,3′,4′,7-四羟基黄酮特征碎片离子。

表1 小绿叶止咳糖浆药液主要化合物

续表1

3.6 皂苷结构解析 皂苷作为常春藤主要有效成分，其苷元主要为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，形式以鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖为主。在鉴定过程中，本实验按照特征碎片及中性丢失的方式来快速寻找化合物，如正离子模式下易产生m/z455.350 6、437.337 5的特征碎片离子，而负离子模式下易产生m/z603.392 6、469.157 0、367.123 7的特征碎片离子。

结果，共鉴定出34种皂苷，包括正离子模式下的续断皂苷K、白头翁皂苷A3、辽东楤木皂苷Ⅶ等，以及负离子模式下的野木瓜糖苷A、α-常春藤皂苷、常春藤皂苷B、川续断皂苷Ⅵ等。以保留时间24.82 min处的假马齿苋皂苷N1为例，离子模式m/z795.451 6[M-H]-，其裂解途径见图3。另外，保留时间18.10 min处的成分推测为常春藤皂苷B，通过对一级离子m/z1 203.630 5[M-H]-的碰撞能量给予，得到失去两分子葡萄糖基、一分子鼠李糖基的碎片离子m/z733.452 2，其裂解途径见图4。

注：虚线为断键方式。图3 假马齿苋皂苷N1二级质谱图及裂解途径Fig.3 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for bacopaside N1

注：虚线为断键方式。图4 常春藤皂苷B二级质谱图及裂解途径Fig.4 MS/MS spectrum and fragmentation pathway for hederasaponin B

3.7 药物移行成分 通过色谱图、碎片离子信息，本实验共发现32种药物移行成分，其中皂苷含量较高，同时检测出5种单独入肺成分，分别为槲皮苷、木犀草苷、三羟基齐墩果酸、罗汉松脂素、川续断皂苷Ⅵ。结合Sciex QTOF中的Swath非数据依赖型采集技术，选择目标化合物中MS/MS响应强度较大的二级碎片离子，形成MRMHR(High Resolution)通道后进行定量研究，发现大部分入血皂苷在1 h左右的含量达到最高，4 h后普遍降低为最低；入肺成分含量较高，并明显高于入血成分的最高值。见图5。

图5 药物移行成分含量分布热图(n=3)Fig.5 Heatmap for content distribution of drug transitional components (n=3)

4 讨论

本实验发现，小绿叶止咳糖浆主要化学成分中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸含量最高，其次为皂苷类成分(假马齿苋皂苷N1、HN-saponin E、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B/C)，其中绿原酸类成分具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、解热、抗病毒等药理活性[14-15]，而皂苷类成分也普遍存在抗炎、祛痰、止咳功效[16-18]。因此，小绿叶止咳糖浆用于治疗咳嗽、预防支气管炎是具有科学依据。

定量分析结果表明，部分黄酮、皂苷类成分入血含量较高，以新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、金丝桃苷、白头翁皂苷B4、假马齿苋皂苷N1、常春藤皂苷C为代表，整体入血分布与小绿叶止咳糖浆主要成分含量基本一致；4 h后，大部分成分在大鼠血浆中处于消除状况，符合皂苷、黄酮类药动学消除特性[19-21]；大鼠肺组织中各成分含量较高，蓄积程度大于血浆，进一步验证该制剂对呼吸道疾病的治疗作用。另外，与空白大鼠比较，给药后大鼠血浆和肺组织中L-酪氨酸、鸟嘌呤、腺苷类成分含量差异较大，体内作用时间较久，并且2 h后存在再次吸收现象，可能是由于上述成分进入机体后可调控生物体相关的代谢通路，使该类内源性物质在整个血浆表达方面呈现二次升高。

综上所述，本实验采用UPLC-QTOF/MS法鉴定了小绿叶止咳糖浆中62个主要化合物，同时检测出大鼠血浆和肺组织中32种药物移行成分，可为该制剂后续质量评价中Q-Marker的确定奠定基础，也能为其临床合理利用提供依据。